实验4_叶绿素的提取、理化性质和含量测定

2.3.2 取代反应
卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、 Cu2+ 、Zn2+等离子取代。
• 2.3.2.1 稀酸 – 去镁 – 铜代
• 2.3.2.2 浓酸 – 去镁 – 水解
2.3.2.1 稀酸 – 叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物 为褐色的去镁叶绿素；
– 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后 的产物为深绿色的铜代叶绿素等；
2.2 叶绿素的物理性质
2.2.1 吸收光谱 2.2.2 荧光现象 2.2.3 含量测定
2.2.1 叶绿素的吸收光谱 红光区：640~660 nm 篮紫光区：430~450 nm
胡萝卜素和叶黄素： 400~500 nm
不用蓝光区测 叶绿素含量。
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2.2.2 荧光现象
叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。
2.3.2.2 浓酸 – 叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可 使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去 镁叶绿酸。
叶绿素→去镁叶绿素→铜代 叶绿素（稳定而不易降解， 常用醋酸铜处理来保存绿色 植物标本）
2.3.3 皂化反应
• 叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被 叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。
2. 叶绿素的荧光现象
取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射 光的颜色有何不同？
3. 光对叶绿体色素的破坏作用
取两支试管，各加入叶绿体色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一 管放在黑暗处，1～2 h后观察两管溶液颜色有何变化？
4. 叶绿素的皂化作用
3ml提取液 +1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀）603℃mi水n 浴 冷却 + 3ml苯（摇匀） + 3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀） 静置，观察分层现象。
叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×稀释倍数×提取液体积] /样品鲜重
6. 注意事项
1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行， 研磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。
2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。 3）分光光度计的正确使用。
7. 思考题
1）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿 体色素往往效果不佳，原因何在？
3 材料、试剂与配备
1 材料 菠菜叶片 2 仪器设备
研钵，漏斗，剪刀，试 管，试管夹，容量瓶 (25ml,50ml)，分光光 度计，水浴锅等 3 试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸， 36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂
4. 实验步骤
1. 叶绿体色素提取
称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中， 加少量石英砂和碳 酸镁及5ml 95％乙醇，研成均浆，过滤入25ml 容量瓶，分别用5ml 95％ 乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用 95％乙醇定容至25ml，放入暗处备用。
实验四 叶绿素的提取、理化性质 和含量测定 （p130－136）
一、叶绿素的提取 二、叶绿素的理化性质 三、叶绿素含量的测定
1. 实验目的
1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法 2）了解叶绿素的理化性质
2. 实验原理
2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质
• 吸收光谱 • 荧光现象
• 故叶绿素浓度 C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml )
• 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积 ×稀释倍数]/样品鲜重
2.3 叶绿素的化学性质
2.3.1 叶绿素的结构 2.3.2 取代反应 2.3.3 皂化反应
2.3.1 叶绿素 的结构
• 叶绿素a与b很 相似，不同之 处仅在于Chla 第二个吡咯环 上的一个甲基 (-CH3)被醛基 (-CHO)所取代 即Chlb。
2）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？ 3）叶绿素a、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸
收峰波长进行叶绿素a、叶绿素b的定量分析？为什么？
加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。 具体的情况是这样的：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中， 由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的 细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏， 使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的 酸性，可起到保护叶绿素的作用 。
• 叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。
皂化分层
• 叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶 于稀酒精溶液中，不能进入苯层；
• 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中
• 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳 白色的溶液
• 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳 化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。
2.3 叶绿素的化学性质
• 取代反应 • 皂化反应
2.1 用含水的有机溶 剂提取叶绿素
亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带
正电性，与其相联的氮原子则偏向 于带负电性，因而卟啉具有极性， 是亲水的，可以与蛋白质结合。
亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组
成的双萜，是一个亲脂的脂肪链， 它决定了叶绿素的脂溶性。
下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）； 上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 对照：另取3ml 叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和2ml 蒸馏水观察与皂化 的叶绿素有何不同？
5. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用
1）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇 匀，观察溶液颜色的变化。
2）当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉，水 浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。
3）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色 变化。
6. 叶绿体色素含量测定
吸取叶绿体色素提取液5ml，用95%乙醇定容至50ml。以95%乙醇为空白 对照，在波长652nm下测定吸光度，并计算总叶绿素的浓度。 最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：
透射光下
反射光下
叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从 第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。
分子吸收的光能有一部分消耗 于分子内部的振动上，发射的 荧光的波长总是比被吸收光的 波长要长
2.2.3 含量测定
• 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和 645 nm；
• 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（34.5）， 测OD652求出叶绿素a、b总量。