药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展

生物技术通报

BIOTECHNOLOGY

BULLETIN

2009年增刊

·技术与方法·

1前言

蛋白质在人类个体的生长发育与健康生活方

面扮演着及其重要的角色。所有人的绝大部分蛋白质水平几乎是相同的,估计约有0.2%的调节蛋白质可能有差别。这几十个调节蛋白质在人的生命活动中起着重要的作用,对人的神经系统、血液循环系统、消化代谢系统、免疫系统等的正常活动发生

重要的影响。这些调节蛋白质由于遗传、环境或年龄等因素引起基因突变、缺失、或表达不正常,就会导致人类疾病。因此这些蛋白质成了治疗这类治病的不可缺少的药物。然而,这些天然蛋白质往往含量极低,提取极其困难,价格非常昂贵,令人望而生畏。例如,美国红十字会两年前公布的用于治疗血友病的蛋白药物Factor VIII (F8)[1]价值每克为

收稿日期:2009-02-26

作者简介:吴应积(1946-),男,内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室特聘教授,研究方向:精原干细胞基

因工程;E-Mail :wuyj1211@

药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展

吴应积张学明杨东山罗奋华旭日干

（内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室，呼和浩特010021）

摘要：用乳腺生物反应器生产人类珍稀的药用蛋白已经构成了现代生物技术的一个重要领域。与其他的生物工程方法比起来，用乳腺生物反应器生产人类珍稀的药用蛋白具有更多的优点。这一生物技术的实际应用依赖于基因的时空表达调控操作和可靠的转基因动物制作方法。综述了这一技术的优点，概括描述了了乳腺生物反应器表达载体的构建方法，及转基因动物的制作方法。讨论了这些方法的优缺点及技术改进的发展方向，特别是介绍了最近出现的、有研究和应用价值的用精原干细胞制作转基因动物的方法。

关键词：乳腺生物反应器载体构建转基因技术

Progress in Technologies and Novel Approach for Preparing

Mammary Gland Bioreactors Produced

Pharmaceutical Proteins

Wu YingJi Zhang Xueming Yang Dongshan Luo Fenhua Xu Rigan

（Key Laboratory of China Education Ministry for Research of Mammal Reproductive Biology and Biotechnology Inner Mongolia

University,Hohhot 010021）

Abstract ：Production of pharmaceutically human valuable proteins using mammary gland bioreactors constitutes an important field of modern pare with other bioengineering technologies,using mammary gland bioreactor to produce the proteins possess more advantages.The practical applications of the biotechnology depend on regulation of the developmental stage and tissue specific gene expression and reliable techniques to prepare transgenic animals.In the present review,the advantages of this technology are described;the methods for constructing the expression vectors of mammary gland bioreactors and for creating transgenic animals are outlined.The strongpoint and shortcoming as well as the progress orientation of each method are discussed.Especially,newest emerged technology for creating transgenic animals by using spermatogonial transplantation,which is valuable in research and application,are introduced.

Key words ：Mammary gland Bioreactor Vector construction Cransgenic technology

2009年增刊吴应积等:药用蛋白质乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展

2,900,000美元,这也许是地球上最贵的物品。Fac⁃tor IX(F9)约为每克40,000美元。大多数人类调节蛋白的市场价格平均为每克1000美元,作为药物,每一种人类调节蛋白的世界市场销量估计可达到10~50亿美元[2]。社会需求激发了对生产这类蛋白的技术研究。乳腺生物反应器由于具备较多的优点,在各类生产技术中脱颖而出,成为生产这类药用珍稀蛋白的首选方法。过去将近二十年来对乳腺生物反应器的研究已积累了许多方法和经验,并在研究中产生了约100种药物的乳腺生物反应器[3]。已取得的研究成果使药物学革命处在一个新的开端。欧洲药品局2006年6月初批准了第一个用乳腺生物反应器生产的药品ATryn(抗凝血酶)在欧盟上市[4],为这一轮新的药物革命吹响了冲锋号,将推动乳腺生物反应器的研究和应用进入一个新的高潮。本文叙述了乳腺生物反应器用于药用蛋白生产的优点,回顾了重要的乳腺生物反应器研制方法,介绍了近来出现的新方法,并对各种方法存在的优缺点做了评述。

2乳腺生物反应器生产药用蛋白的优点动物乳腺生物反应器是目前为止开发得最为成功的动物生物反应器之一,大量的研究表明,各种各样的重组蛋白都可以通过此途径获得,其中包括一些相当复杂的蛋白分子[5~9]。选择乳腺表达动物主要考虑产奶量、繁殖周期、外源基因的表达难易等因素。小鼠是研究得比较多的转基因模式动物,但小鼠分泌的乳汁量太少,并不适合商业化生产,因此一般把小鼠作为模型来检测外源基因的表达。家兔由于繁殖周期短、性成熟快、后代多,因此适合用来生产需求量较小的药物蛋白。从生物维持成本和产奶量的角度来看,用以食草为主的乳用型家畜动物进行转基因乳腺生物反应器研究比较理想。概括起来,利用家畜动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有以下优点:

1)乳腺可以不断分泌奶汁,长期收集不会对动物造成伤害;

2)对动物的生理活动影响小,药物蛋白限制在乳腺内生产,分泌到乳汁中,不会进入血液,不会对转基因动物的正常生理活动造成影响;

3)生物活性高,家畜乳腺可对表达的蛋白质进行糖基化、酯化、磷酸化和形成多具体等一系列翻译后加工,产品接近天然提取物,活性高,不易产生抗药性。

4)产量大,易提纯。动物乳腺每年产奶量多,因而目的蛋白表达量多。如一头牛每年可产奶8 000~10000L,奶中蛋白含量占3.2%~3.6%,则一头牛一年可生产蛋白近300kg;一只羊产奶600~ 800L,可生产纯蛋白20~30kg;一只家兔也可以产2kg纯蛋白。药用蛋白基因在乳腺中的表达效率高,可达到每升几克到几十克。乳汁中含有的其他蛋白质成分比较明确,目的蛋白纯化工艺相对较为简单容易。

5)设备简单,无环境污染。转基因动物只需饲养在洁净的环境,并不需其它特殊设施,基本上是一个畜牧业过程,不会造成环境污染;生产的药用蛋白为纯生物制品,避免了化学试剂及生物毒素的污染。

6)开发周期短。目前一种新药从研制开发到上市约需15至20年。如果技术成熟后利用动物乳腺来生产,仅需5年左右。如以转基因动物研制的周期来计算,转基因羊从显微注射到泌乳的周期是18个月,也就是说18个月即可以进入生产阶段。

7)生产成本低,经济回报丰厚。用转基因动物乳腺反应器生产药用蛋白是新型朝阳产业。据测算,用传统的细胞培养生产1克基因工程药物,平均成本为100~1000美元,而利用动物乳腺反应器生产成本仅需10~25美元。美国D&MD公司的市场分析报告显示,2025年仅美国的生物药品的需求量就将达到每年860亿美元。

3蛋白质药物乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展

乳腺生物反应器的制作技术分为两个大的部分。其一是乳腺生物反应器表达载体的构建,其二是通过生殖系统细胞操作将表达载体导入胚胎以产生转基因动物。表达载体的类型对目的基因在染色体中的整合方式、表达调控模式及表达效率等有直接的影响。生殖系统细胞操作则是产生转基因动物的关键步骤。病毒类表达载体由于自身的局限性,在乳腺生物反应器的制作中应用价值不大,在这里不加以讨论。

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