酶的分离纯化 ppt课件

膜
膜
透析袋 酶溶液
水
渗透
盐类 水
透析
蒸馏水
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三、膜分离技术的基本流程
料液罐
浓缩液（回流液）
渗出液
泵
膜组件
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四、生产中常用的膜分离装置
中空纤维超滤器 中空纤维膜分 离装置是将成束的中空纤维装入 一筒内，两端封闭。当轴流通过 管腔时，造成高剪切力，在截留 溶质分子的同时，将浓度降至最 低限度。每根中空纤维内腔直径 为0.2mm,中空纤维由惰性的非离 子聚合物制成．具有各向异性、 抗堵塞性，运用成束纤维表面积 大，流量大、阻留溶质的浓度范 围(4％一20％左右) 如右图。
PAA + 酶 + Ca 2+
PAA- Ca 2+ + 酶
PAA- Ca 2+ + SO4 2-
CaSO4 + PAA
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（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性 沉淀，而不影响所需的酶。
1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在 较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。 2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸 碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。
4
第四章 酶的分离纯化及产品成型
本章知识点：
（
的）
（1）酶的抽提
纯酶
（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、
度 监
纯 化
膜过滤、层析分离、电泳分离 测 过
（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型
程
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一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化 等过程。 生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技 术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标 产物成为现实。
水
水
渗透
溶质
水
水
反渗透
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（四） 电渗析
在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离 的目的。
+
膜
-
膜
酶液
-
+
应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、 纯水制备等
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（五） 透析
应用：在生物分离方面，主 要用于生物大分子溶液的脱盐。 由于透析过程以浓差为传质推 动力，膜的透过通量很小，不 适于大规模生物分离过程，而 在实验室中应用较多。
适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂
（3）调pH值 二、固液分离 方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
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三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机
机械破碎法
研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
物理破碎法
温度差破碎法：冻融交替法 压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
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灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
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四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%； 基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上； 青霉素回收过程成本约占50%； 乙醇的回收过程成本仅占14%。
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二、分离纯化的一般流程
原料液
线路1
细胞分离（离心、过滤）
线路2
细胞（胞内产物）
清液（胞外产物）
细胞破碎
碎片分离
粗分离
纯化 成品化
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人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗 肝炎等作用。
Yonehara等人：
醋酸锌盐析
（83.0%）
离子交换层析
（62.7%）
硫酸铵盐析
（96.2%）
铜螯合层析
（46.0%）
疏水层析
（78.3%）
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素 （1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。 （2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。 （3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。 （4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。
A、B — 与温度有关的经验常数
B（g/L） 514.72 525.05 536.34 541.24 545.88
（mol/L）
3.09
3.97 武汉生物4工.0程6学院生物工4程.1系0酶工程教4研.1室3
(25℃)
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当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
离子交换层析、电泳分离
根据稳定性差异 根据亲和作用
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法 亲和层析、亲和电泳
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第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
（三）有机溶剂沉淀法
1、作用原理 去水膜；降低介电常数、破坏氢键。
2、注意 低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。
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（四）复合物沉淀法
1、原理 2、常用的复合沉淀剂：
单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。
PAA + 酶 PAA-酶 pH6以上
PAA-酶 PAA + 酶
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
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一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
2、按膜孔径或截留物质的大小：
水
超滤（UF）
（10-200nm）
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
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各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
（NF） 2nm~10nm 反渗透 （RO） <2nm
例：某酶制剂厂生产15吨蛋 白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析, 要求硫酸铵的饱和度达到40%， 计算需要加入固体硫酸铵多少kg? （25℃）
W=
B（S2 - S1） 1 － AS2
3680Kg
经验常数W — 将01℃L饱和度10为℃S1的溶20液℃提高2到5℃S2所 30℃
要添加的固体硫酸铵克数；
A
0.271 0.281 0.290 0.294 0.298
灰尘、细菌
微孔滤膜
除菌，回收 菌
生物大分子及以上 超滤膜
蛋白质、多 肽和多糖的 回收和浓缩
生物小分子及以上 纳滤膜 脱盐、浓缩
盐类及以上
盐、氨基酸、 反渗透膜 糖的浓缩、
淡水制造
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二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术
（一） 微 滤(MF)
又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。
（二）酶分离纯化应注意以下问题
1、防止酶变性失活：温度、pH、泡沫、重金属等。 2、选择有效的纯化方法。 3、酶活性测定与总蛋白质含量测定应贯穿纯化过程的 始终。
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第一节 从发酵液制取酶提取液（酶溶液的制备）
一、发酵液的预处理 目的：降低粘度，便于固液分离 方法：（1）加热：
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人：
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
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在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
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3、盐析操作 （1）硫酸铵的饱和度
实际浓度 （NH4）2SO4 的饱和度（%）= 饱和浓度 ×100%
0.4S = 40%（饱和度）
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（2）调整盐浓度的方法
例：将2升0.2S的硫酸 铵溶液提升至0.5S，需加饱
（1）截留颗粒直径：0.2~2 um。 （2）操作压力：低于0.1 MPa。 （3）应用：
实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵 液中的细胞。
无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药 物和营养物质的过滤除菌等
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（二） 超 滤(UF)
可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。 （1）截留颗粒直径：10~200 nm。 （2）操作压力：0.1~0.7MPa。 （3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶 液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。
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第三节 膜过滤技术在酶分离纯化中的应用
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不 同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离、提 纯或浓缩的新型分离技术。
膜分离技术已被国际上公认为20世
纪末至21世纪中期最有发展前途，甚
至会导致一次工业革命的重大生产技
渗出液
术，所以可以称为前沿技术，是世界
和硫酸铵多少升？溶液体积
加饱和（NH4）2SO4 溶液： 增加多少倍？
V=
Baidu Nhomakorabea
V0（S2 - S1） 1 - S2
V0 — 原来溶液的体积 V— 所需加入饱和硫酸铵的体积 S1 — 原来溶液的硫酸铵饱和度 S2 — 所需达到的硫酸铵饱和度
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加固体（NH4）2SO4 ：
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（二）等电点沉淀
1、原理 2、实际操作
与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较 大的杂蛋白 。
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
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酶分离纯化方法：
现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定 性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。
分离依据的性质
分离方法
根据分大小、轻重
离心分离、凝胶过滤、膜分离
根据溶解度大小 根据电学性质
盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、 选择性沉淀、等电点沉淀
再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和 条件。
最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋 白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降, 酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。
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三、酶分离纯化的基本原则
（一）酶分离纯化包括三个基本环节
抽提
纯化
精制
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（三） 反渗透(RO)
在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻 挡于膜壁外。
（1）截留颗粒直径：小于2 nm。
（2）操作压力：1~8 MPa。 （3）应用：主要用于分离各种离子和小分子物质。
在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛 应用。
膜
膜
溶质
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
（一）抽提方法 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂
（二）抽提过程中的注意事项
1、pH值：选择的pH值不超出酶的酸碱稳定范围；
最好远离待抽提酶的等电点。 2、温度：通常控制在0~4℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。 3、抽提液体积（用量）
抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次 反复抽提。 4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。