多粘芽孢杆菌检测方法
多粘类芽孢杆菌分类_解释说明以及概述
多粘类芽孢杆菌分类解释说明以及概述1. 引言1.1 概述多粘类芽孢杆菌（Multicellular Sporogenic Bacilli）是广泛存在于自然环境中的一类细菌。
它们具有独特的生态角色和功能，对各个领域包括医学、农业和环境等都有重要的应用价值。
对多粘类芽孢杆菌进行正确的分类研究，不仅有助于深入了解它们的分类学特征和系统发育关系，还能揭示其对生物多样性和环境影响的作用机制。
1.2 文章结构本文主要围绕多粘类芽孢杆菌分类展开论述。
首先介绍了文章的整体结构，包括引言、多粘类芽孢杆菌分类、解释说明多粘类芽孢杆菌分类意义、现状与挑战以及结论五个部分。
在每个部分中，会详细描述相应内容并提供相关研究和发展现状。
1.3 目的本文旨在全面阐述多粘类芽孢杆菌分类的重要性，并深入讨论其生态角色、应用价值以及对于环境和生物多样性的影响。
同时，对多粘类芽孢杆菌分类研究的现状和挑战进行回顾，并对未来的发展方向提出建议和展望。
以上为文章“1. 引言”部分的内容，旨在概述论文的主题、结构和目的。
2. 多粘类芽孢杆菌分类2.1 定义与特征多粘类芽孢杆菌（viscous spore-forming bacteria）是一类革兰氏阳性细菌，它们具有形成气囊状芽孢和薄层黏液的特征。
这些细菌通常在土壤、水体和动植物体表等环境中广泛存在，并且对于生态系统的平衡和功能发挥着重要作用。
在形态上，多粘类芽孢杆菌呈长杆状或丝状，其表面覆盖着黏液层，使得它们能够吸附并固定在环境中的不同介质上。
2.2 分类方法与标准多粘类芽孢杆菌的分类主要依据其生理学和生化学特征进行。
常见的分类方法包括形态观察、生长条件和代谢产物分析等。
其中，最常用的鉴定手段是通过16S rRNA基因序列分析进行系统发育研究，从而确定其亲缘关系和进化演化。
2.3 分类系统与进化关系根据现有研究成果，多粘类芽孢杆菌可分为多个属，如黏杆菌属（Viscillium），蓝杆菌属（Cyanobacterium）等。
5-芽孢杆菌检测试验方法
芽孢杆菌检测试验方法所用的分析天平，移液管，滴定管，容量瓶等玻璃器皿按有关检定规定定期校正。
所用的水，在未注明其他要求量，均指蒸馏水或去离子水，所用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯(A.R)4.1 感官指标：4.1.1 感官特性：从抽取的样品中，取适量倒在白纸或玻璃板上，在光线充足的条件下，观察颜色和状态，并品尝滋味，闻其气味。
4.1.2 过筛率：随机抽取500 g样品，取40目和20目的筛子，将样品取出100g 称重，过筛，再次称重，计算过筛率。
过筛后的总质量过筛率=-----------------×100%过筛前的总质量4.2菌种鉴别4.2.1菌落形态：培养24小时，暗白色或浅黄色圆形菌落，中央有小突起，不透明，表面干燥，菌落易挑起。
4.2.2 镜检菌体形态：0.5-0.6*2.5-3.5微米，杆状，中生芽孢、即使孢囊膨大、也不显著。
4.2.3 革兰氏染色：革兰氏阳性菌。
4.3 芽孢杆菌活菌总数4.3.1仪器、设备、试剂和培养基a.分析天平，感量为0.01g；b.恒温水浴锅；c.震荡器；d.高分辨力相差显微镜；e.湿热灭菌锅；f.超净工作台；g.研钵；h.血球计数板，XB-K-25；i.血球计数板专用盖玻片，20mm×20mm；j.加样枪；k.各类玻璃器皿。
9ml0.85%的无菌生理盐水试管，80ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，30ml 0.85%的无菌生理盐水的三角瓶，空的500ml三角瓶（内装10～15颗玻璃珠），空的20ml的刻度试管，1ml吸管，培养基配方：营养琼脂粉38g，蒸馏水1000ml。
上述物品，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。
在超净工作台上将灭好菌的营养琼脂倒平皿，每个大约20ml，放在紫外灯下吹风1小时，然后放在工作台面过夜，第二天备用。
4.3.2 预处理：准确称取样品 1.00克，将其全部转入一只已消毒的直径约10厘米的研钵中，从上述30ml 0.85%的无菌生理盐水三角瓶中取出约5ml水加入研钵，研磨10分钟，然后使用无菌生理盐水将其全部转移到空的20ml的刻度试管中，定溶至20ml，用振荡器震荡2分钟，将其全部震荡均匀。
芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变的研究(可编辑)
芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变的研究（可编辑）芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变的研究福建农林大学硕士学位论文芽孢杆菌的分类鉴定及其相关属的分类系统演变研究姓名:刘国红申请学位级别:硕士专业:植物检疫指导教师:林乃铨;刘波20090401中文摘要采用稀释涂布法从我国15个省15份土样标本中分离出322株芽孢杆菌。
通过表型特征、脂肪酸成分、ITS测序等手段将322株菌鉴定为3个属，芽孢杆菌属Bacillus11个种，类芽孢杆菌属Paenibacillus属2个种，短短芽孢杆菌属Brevibacillus属2个种。
本文对芽孢杆菌的生物学特性进行了研究，观察了枯草芽孢杆菌、简单芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌的细胞形态，并对几种常见芽孢杆菌的菌落形态进行了描述，也对枯草芽孢杆菌的生长特性做了相关的研究。
根据鉴定结果，统计分析了我国部分省芽孢杆菌的多样性，研究结果表明每个样点分离到芽孢杆菌的数量差异很大，每个采样点的优势种群的种类和数量也有很大差异。
15个采样点土样分离到的芽孢杆菌丰富度在2(8之间。
其中，青海采样点的芽孢杆菌丰富度最小，只分离到2种;新疆、内蒙古和宁夏芽孢杆菌的丰富度最大，为8。
新疆采样点的丰富度和多样性指数最高，其均匀度指数较高，生态优势度指数较低。
西藏的芽孢杆菌丰富度较低，多样性指数和均匀度指数最低，生态优势度指数最高。
因此物种多样性不仅与物种的丰富度有关，还可能与物种间数量差异程度有一定关系。
本文还初步研究了芽孢杆菌对香蕉枯萎病病原菌和青枯雷尔氏菌的拮抗作用，筛选到22株对香蕉枯萎病病原菌有拮抗作用，15株对青枯雷尔氏菌有拮抗作用。
从空间分布来看，具有拮抗作用的菌株大部分是从北方各省分离到的。
(最后，本文讲述了芽孢杆菌属属水平上的分类变化现状，叙述了芽孢杆菌属相关属的分类依据种有112个。
本论文还根据IJSEM上发表的文章对112个芽孢杆菌种的特征进行整理，记录了每个种的特征、16SrRNA序列号和菌株编号。
多粘芽孢杆菌颗粒剂检测方法
多粘芽孢杆菌颗粒剂检测方法1、检测仪器、设备分析天平净化工作台磁力搅拌器微型漩涡振荡器超声波水浴器水浴锅恒温培养箱磁性棒250mL蓝口瓶5mL移液枪、枪头100mL刻度量筒1000μL移液枪、枪头100μL移液枪、枪头涂棒90mm培养皿2、培养基、试剂和溶液配制（1）检测培养基：土豆200g蔗糖20g 琼脂粉15g 蒸馏水1000mL 分装、灭菌、倒平板备用。
（2）10%吐温80溶液：准确移取10ml吐温80于100ml容量瓶中，用水定溶，分装、灭菌备用。
（3）生理盐水：9gNaCl用水定溶1000ml，分装400ml每瓶，灭菌备用。
3、测定步骤3．1 样品的预处理试样按照相同的方式处理，重复检测3次。
a)稀释液的配制：按照1‰的比例在无菌生理盐水中加入灭好菌的10%吐温80溶液，混合均匀，待用。
b)样品的称取：称取0.99—1.01g（准确至0.0002g）的试样倒入无菌蓝口瓶中。
c)试样母液的处理：（1）准确量取稀释液100ml，加入已经称好试样的蓝口瓶中后放在磁力搅拌器平台上，混合15分钟时剧烈摇动1分钟，再次混合15分钟，一共混合30分钟。
（2）将已混合好的试样母液放入超声波水浴器中（超声波水浴器水平面必须等同于试样液面试样瓶应放在超声波振源处），超声15分钟（7分钟时停止，猛烈摇动试样瓶，然后再超声8分钟）。
（3）在超声之后，再次用磁力搅拌器混合60分钟。
3．2 样品的稀释a) 向4支无菌试管分别加入4.5ml稀释液，试管上标记样品号和稀释倍数的字样。
操作在超净工作台中进行。
b)吸取0.5ml已处理好的试样母液于加入第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5ml稀释液于第2支试管，依次进行到第3支试管（每次加液后，需混合均匀，再进行下一次操作）。
c）将已混好的第3支试管放入70℃水浴锅中水浴30分钟后放入冰水中冷却至常温，然后准确吸取0.5ml该试管中的稀释液于第4支试管，混匀，备用。
4．3 稀释样品的平板培养准确移取0.1ml的第4支试管中的稀释液到每个营养琼脂平板中（共5个平板），各平板均标上分析号、日期、稀释度。
农业部免作安全鉴定一级菌种——多粘类芽孢杆菌简述
胞膜的渗透性，造成细菌内含物的流失，最终导致 细 菌 死 亡。 ② 作 用 于 真 菌 细 胞 壁， 多 粘 芽 孢 杆 菌 产 生 的 拮 抗 蛋 白 质 大 多 数 为 细 胞 壁 降 解 酶 类， 如 β-1,3- 葡聚糖酶、几丁质酶等。β-1,3- 葡聚糖酶 可水解 β-1,3- 葡聚糖中的 β-1,3- 糖苷键，从而 抑制植物病原真菌的生长与增殖。同时，分泌的核 苷类抗菌素多氧霉素作用于病原真菌细胞壁，能引 起真菌生长时的菌丝尖端形成膨胀泡而破裂。③活 菌体直接抑制，多粘类芽孢杆菌活菌体能抑制镰刀 菌的生长，而无菌滤液对镰刀菌无作用。这说明这 株多粘类芽孢杆菌对镰刀菌的抑制是活菌体直接起 抑制作用。④保护作用，多粘类芽孢杆菌可以产生 胞外多糖，保护植物免受病原体侵害；该菌和植物 根系的相互作用也会导致根毛发生物理变化。 3. 诱导作用：多粘类芽孢杆菌不仅能直接杀死 病原菌，还能通过与植物之间的互作来起到抗病效 果。诱导植物系统抗性是植物被环境中的非生物或 生物因子激活产生的对随后的病原菌侵染具有抵抗 性的特征。 4. 提供营养：多粘类芽孢杆菌能够通过固氮和 溶磷为植物提供植物自身难以吸收的氮源和磷肥养 料。多粘类芽孢杆菌能在植物根尖定殖并形成生物
农化科技
农业部免作安全鉴定一级菌种 ——多粘类芽孢杆菌简述
多 粘 类 芽 孢 杆 菌（Paenibacillus polymyxa Ash, Priest ＆ Collins）是一种产芽孢、具有固 氮能力的革兰氏阳性细菌，多粘类芽孢杆菌及其代 谢产物广泛应用于农业、医学、工矿业及废水处理 等方面，美国环境保护署（EPA）已将其列为可商业 上应用的微生物种类之一，此外我国农业农村部也 将其列为免做安全鉴定的一级菌种。
芽孢杆菌检测方法及注意事项
芽孢杆菌检测方法及注意事项枯草、地衣芽孢杆菌检测方法及注意事项一、检测方法1.试剂和培养基1.1 样品稀释液：准确移取1mL吐温80，9gNacl用水定溶1000mL，分装400mL每瓶，灭菌备用。
1.2 芽孢杆菌培养基：蛋白胨：10g酵母浸粉：5gNaC1盐：10g琼脂粉：15gPH值：7.0～7.2蒸馏水：1000mL分装，121℃，30分钟蒸汽灭菌后备用。
2.检测步骤2.1样品处理（每个样品至少重复检测2次）a) 称取1～3g(准确至0.0002g)的试样或标样于250 mL内置磁性棒的中性瓶中（1000亿称1 g左右，2000亿称3 g左右，3000亿称2 g左右，5000亿称1.2 g左右，称样量视具体芽孢数而定）。
b) 加100 mL稀释液到已称样的中性瓶内。
c) 把上述中性瓶放在磁力搅拌器平台上,混合15min；之后再猛烈摇动1min，再次磁力搅拌混合15min。
d) 将已混合好的试样放入超声波水浴器中（超声波的水平面与试样液面平齐，试样瓶应放在超声波振源处），共超声20min（10min 时停止，猛烈摇动试样瓶1 min，然后再超声10min）。
e)超声之后，再次用磁力搅拌混合60min.2.2样品的稀释a）向无菌试管分别加入4.5mL稀释液(1000亿6支，2000亿、3000亿、5000亿7支)。
b)吸取0.5mL已处理好的试样溶液于第1支试管中，再从第1支试管吸取0.5mL试样溶液于第2支试管，依此进行到倒数第二支试管(每次加液后,需混合均匀，再进行下一次操作)。
c) 将已混好的倒数第二支试管放入70℃水浴锅中水浴30min。
冷却至室温后准确吸取0.5mL该试管试样溶液于最后一支试管，混匀、备用。
每次操作必须使用无菌枪头，枪头不可重复使用。
2.3 涂平板及培养从最后一支试管中准确移取0.1 mL的试样到每个营养琼脂平板中（共4个平板），各平板均标记上分析号、日期、稀释度。
使用1支涂棒，将已放在平板中的试样扩展开（从中心往外移，成辐射状扩展）；在扩展完4个试样平板后，涂棒在1个空白营养琼脂平板上进行涂布（保证涂棒上沾附的活芽胞数也能进行培养、计数）。
多粘类芽孢杆菌 (1)
多粘类芽孢杆菌1.基本特性1.1中文通用名称：多粘类芽孢杆菌1.2英文通用名称（或拉丁名称）：Paenibacillus polymyxa1.3毒性：低毒1.4应用作物：棉花、玉米、水稻、花生、马铃薯、黄瓜、青椒1.5防治对象：棉花黄萎、黑根腐、炭疽病、赤霉病；玉米全蚀病；水稻白叶枯病；花生青枯病；马铃薯软腐病；黄瓜角斑；青椒疮痂1.6生防特点：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对植物黄萎病、鹰嘴豆枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害均具有一定的控制作用。
美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一。
无论是采用HY96-2（P. polymyxa）发酵液，还是由HY96-2制成的细粒剂(KDLD)，在温室内和田间都取得了稳定的防治效果，并且KDLD细粒剂在田间表现的效果更为突出。
2.定性鉴别试验2.1菌株的形态及培养特征类芽孢杆菌属。
菌株接种于 LB固体培养基上，28ºC培养 18～24 h，观察其菌落形态。
利用光学显微镜观察在LB培养基上生长菌体形状和革兰氏染色情况，利用电镜观察菌体大小、荚膜和鞭毛着生情况。
菌体大小为(0．6～ 0．8) μm ×(2．0～5．0) μm，革兰氏阳性、阴性或可变，兼性厌氧，杆状，产芽孢，芽孢椭圆形，端生，膨大，有荚膜，鞭毛侧生或周生。
在 PDA平板上，菌落较小、白色或淡黄色、圆形、菌面稍凸或不凸起，边缘整齐，表面有光泽、光滑、湿润、半透明到不透明；在肉汁琼脂培养基上生长菌落较薄，无菌膜，液体澄清；在斜面培养基上生长良好，菌苔线状、扁平，表面光滑、半透明。
最适合生长温度30-35 ºC表1 菌株在不同培养基中的培养特征（30ºC ，2天）培养特性LB琼脂营养琼脂酵母浸膏琼脂牛肉汁琼脂菌落颜色乳白色杏仁白色淡黄白色灰白色菌落形状湿润光滑粘稠状有小突起，粘性湿润光滑菌落直径mm 2.5 2.8 3 2.62.2生理生化特征由表2可知，菌株的接触酶、厌氧生长、酪朊水解、淀粉水解、V—P反应和硝酸盐还原均为阳性；氧化酶、酪氨酸水解、脲酶、卵黄卵磷脂水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D葡萄糖、D一木糖、D一甘露醇、甘油，且均产酸、产气。
多粘类芽孢杆菌标准
多粘类芽孢杆菌标准多粘类芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌，属于杆菌科，可以产生多种有益物质和酶。
由于其对环境友好、易于培养和培养基制备成本低等优点，多粘类芽孢杆菌已成为许多研究领域和应用领域的重要模式生物和工业微生物。
一、基本信息多粘类芽孢杆菌的形态特征为直杆状，大小约为1-2微米×4-8微米。
菌体质地坚韧，具有黏附作用。
芽孢是其最典型的特征之一，芽孢具有抵抗外界环境的能力，在极端条件下也能存活。
二、培养条件1. 基本培养基：以肉汤-蛋白胨培养基为基础，可加入适量的葡萄糖、淀粉等碳源，适量的无机盐和适宜的pH值。
2. 温度：多粘类芽孢杆菌为嗜温菌，适宜生长温度为30-40℃，最适温度为37℃。
3. pH值：多粘类芽孢杆菌能适应较宽的pH范围，但最适pH为6-8。
4. 氧气条件：多粘类芽孢杆菌为厌氧菌，对氧气耐受能力较强。
三、生物学特性1. 产孢性：多粘类芽孢杆菌产孢能力很强，芽孢可以在环境中长时间存活。
2. 生长速度：多粘类芽孢杆菌生长速度较快，平均每递增20分钟分裂一次。
3. 酶的产生：多粘类芽孢杆菌可以产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等。
4. 干旱抗性：多粘类芽孢杆菌对干旱有很强的抵抗能力，能在干燥环境下存活。
四、应用领域1. 农业领域：多粘类芽孢杆菌在农业生产中有广泛应用，可用于提高作物的营养吸收、防治植物病害、增强植物抗逆性。
2. 生物农药制备：多粘类芽孢杆菌对许多农业害虫有杀灭作用，可制备成生物农药用于害虫防治。
3. 饲料添加剂：多粘类芽孢杆菌可以促进动物的消化吸收能力，提高饲料利用率，可作为饲料添加剂使用。
4. 工业微生物：多粘类芽孢杆菌可以产生多种酶和有益物质，可用于食品、医药、生物燃料等工业领域。
五、实验操作1. 菌体培养：将多粘类芽孢杆菌接种于含有适宜培养基的培养皿中，经过适当的培养条件，利用摇床或恒温培养箱进行培养。
一株拮抗性多粘类芽孢杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效
第51卷第1期2022年1月福建农林大学学报(自然科学版)Journal of Fujian Agriculture and Forestry University ( Natural Science Edition )一株拮抗性多粘类芽抱杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效邓云(福建省南平市农业科学研究所，福建南平354200)摘要：采用平板对峙法从长期开展小麦赤霉病抗性鉴定的鉴定圃土壤中分离筛选出一株具有广谱抗真菌活性的微生物菌 株DY04.结合菌落形态观察和16S rDNA 基因序列分析，将其鉴定为多粘类芽抱杆菌.通过灌根、穗部喷洒原菌液和穗部喷 洒发酵液等3种施药方法研究多粘类芽抱杆菌菌株DY04对小麦赤霉病的防效和小麦产量的变化.结果表明：将该菌株灌 根处理可有效防治小麦赤霉病，防治率达58.43% ；同时，小麦籽粒千粒重比对照增加&83%,理论产量增加45.21%.关键词：多粘类芽抱杆菌DY04；小麦赤霉病；生物防治中图分类号：S482； S481.9文献标识码：A文章编号：1671-5470( 2022) 01-0021-06DOI ：10.13323/ki.j.fafu( nat.sci.) .2022.01.003开放科学(资源服务)标识码(OS1D )Identification of Paenibacillus polymyxa as antagonist to Fusarium head blightof wheat and its field control efficacyDENG Yun(Nanping Institute of Agricultural Sciences , Nanping , Fujian 354200, China )Abstract : A microbial strain DY04 with broad-spectrum antifungal activity was isolated and screened using plate confrontation meth od from nursery soil where long-term study on the resistance of Fusarium, head blight ( FHB) of wheat was carried out. The strain was identified as Paenibacillus polymyxa by colony morphology analysis and 16S rDNA gene sequencing. Three field application methods , namely root irrigation , spraying with viable bacteria on panicle and spraying with fermented liquid on panicle , were used to assess the control effect of DY04 on FHB and wheat yield. The results showed that root irrigation can effectively control FHB, resulting in a maximum control rate at 58.43% ； thousand-grain weight of wheat was 8.83% higher in root irrigation group than that of the con trol, leading to 45.21% increase in the theoretical yield.Key words : Paenibacillus polymyxa DY04 ； Fusarium head blight ； biocontrol小麦赤霉病是世界性病害［|-2］,广泛分布于我国温暖潮湿或半潮湿地区,多发于长江上、中、下游及黄 淮南片区，对小麦生产的危害甚大.该病不仅会造成小麦严重减产，而且其产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒 性强,食用后会引起眩晕、发烧、恶心、呕吐、腹泻等急性中毒症状,同时会降低免疫能力和生育能力等,危 害人畜健康.目前，施用化学杀菌剂是农业生产上控制真菌性病害的主要方法⑶,但是化学农药容易导致 农药残留、环境污染、植物病菌产生抗药性等问题.因此，迫切需要更加安全环保的新型生物农药代替传统 的化学杀菌剂［4-6］.多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa )为芽抱杆菌科(Bacillaceae )类芽抱杆菌属，是一类重要的根 际有益菌⑺少它的代谢产物中含有多种可利用的生物活性物质，如多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、核苷类似 物、毗嗪类、醇醛酸等,在农业、食品和环境等方面具有潜在应用价值•多粘类芽抱杆菌可通过产生的抗菌 物质和位点竞争的作用方式杀死和控制病原菌［宀⑸，且该菌是非致病性细菌，被广泛应用于微生物制剂 的研制•此外，该菌具有活性高、环境污染小以及不易产生抗药性等特点，具有巨大的生防价值［16一17］.收稿日期：2021-05-17 修回日期：2021-06-28基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFD0101000).作者简介：邓云(1981-)，女，高级农艺师•研究方向：植物保护与抗病育种.Email ：25362663@ .-22-福建农林大学学报(自然科学版)第51卷目前,有关广谱抑制真菌的多粘类芽抱杆菌的报道不多，市面上可用于防治小麦赤霉病的多粘类芽抱杆菌的微生物农药菌种资源也不够丰富;有关多粘类芽抱杆菌的主要研究方向为其生物特性和对土壤及作物的作用机理[18-23].本研究从常年开展小麦赤霉病抗性鉴定的鉴定圃土壤中分离出一株具有广谱抑菌效果的多粘类芽抱杆菌DY04,研究其不同施用方法对防治小麦赤霉病和小麦产量的影响，以期为小麦赤霉病的生物防治提供种质资源,并为该生防菌的实际应用提供理论依据.1材料与方法1.1材料1.1.1生防菌菌株菌株DY04分离自福建省南平市建阳区童游街道南平市农业科学研究所试验基地的小麦赤霉病抗性鉴定圃土壤.1.1.2病原真菌菌株禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)A稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)由本课题组分离；玉米平脐蠕抱(Bipolaris sp.)、茶拟盘多毛抱(Pestalotiopsis theae)、玉米茎点霉属(Phoma sp.)、番茄尖抱镰刀菌(F.oxysporum)、香蕉枯萎病尖抱镰刀菌(F.oxysporum f.sp.)、黄萎病镰刀菌(F.verticillium)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)等由福建农林大学植物保护学院鲁国东教授提供;玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)由福建省农业科学院植物保护研究所陈福如教授、杜宜兴副研究员提供.1.1.3供试小麦品种供田间试验的小麦品种扬辐麦4号由扬州里下河农业科学研究所提供.1.1.4培养基红糖豆粉培养基(发酵液)[20]:红糖23.3g-L-',CaC034.9g-L\豆粉11.1g-L'1, KNO38g•L_i,KH2P040.5g-L_l,K2HP041.2g•L_l,MgS04-7H205g-L_l,NaCl3g-L_I.PDA培养基：马铃薯180~250g,葡萄糖15~25g,琼脂15~20g,水1000mL.1.1.5微生物菌液助剂添加剂配方为分散剂PVA(聚乙烯醇)7.2%、湿润剂D425(烷基磺酸缩聚物) 4.8%、稳定剂CMC-Na(羧甲基纤维素钠)2.0%、保护剂FWA(荧光增白剂)0.1%[24].1.2室内测定方法1.2.1染菌大麦粒诱导分离拮抗菌株DY04将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却至室温，向装有大麦粒的瓶中接种禾谷镰刀菌菌块，并在25~26弋条件下培养5~6d,其间摇动培养瓶2~3次，使大麦粒充分长满禾谷镰刀菌.使用若干块无菌纱布分别包裹数颗已长满禾谷镰刀菌的大麦粒，并逐份扎口、系好标签，将其掩埋在鉴定圃土壤10~20cm的深度诱导拮抗菌附着在染菌大麦粒上,20d后取出，并分别装入灭菌后的玻璃瓶内,做好标记待用.取出大麦粒洗净消毒后，置于PDA平板培养基上培养3 ~5d,观察染菌大麦粒菌丝发展情况.挑取没有明显菌丝扩张的培养皿内的拮抗菌,进行分离纯化培养,得到拮抗菌株DY04[25].1.2.2拮抗菌株DY04对病原真菌的防效测定采用平板对峙法[26]进行测定.将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却至室温，向装有大麦粒的瓶中接种拮抗菌DY04菌块，并在28弋条件下培养1~ 2d,让拮抗菌侵染全部大麦粒.将病原真菌的菌丝块接到PDA培养基(9cm培养皿)的中央，在距离中央2.5cm的左右两侧各嵌入一粒携带拮抗菌株DY04的大麦粒，以中央只接种真菌菌块的PDA平板为对照,所有培养皿封口后于28弋下培养5~7d,观察生长情况.每个处理3次重复，当对照菌丝长满整个培养皿时，测定每个培养皿真菌菌落直径，计算抑制率.抑制率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径X100.1.2.3菌落形态特征鉴定挑取菌株DY04培养24h,用100咽无菌水制成菌悬液[20]，然后划线于PDA 平板上,28T恒温培养48h,观察菌落的形态特征.1.2.416SrDNA序列同源性测定提取拮抗菌株DY04的DNA,由生工生物工程(上海)股份有限公司提取并测序,琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,PCR所用的引物融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物341F(上游引物5，-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3，,下游引物5，-CCTACGGGNGGCWGCAG-3，)和805R(上游引物5，-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3,,下游引物5，-GACTACHVGGG-TATCTAATCC-3，).PCR反应体系：2xTaq master Mix15fiL,Bar-PCR primer F(10pimol•L-1)1»L,Primer R(10pmol-L-1)1pL,Genomic DNA10~20ng,H20加至30pL.PCR扩增程序:94T预变性5min；94弋第1期邓云:一株拮抗性多粘类芽抱杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效・23・变性30s,55°C退火20s,72°C延伸30s,共设置25次循环，最后72°C延伸5min.16S rDNA序列在核糖体数据库（/index.jsp）中进行BLAST比对.1.2.5拮抗菌株DY04发酵液的抑菌效果测定挑取DY04菌株在红糖豆粉培养基发酵液中培养2d后,在12000r・min-1条件下离心10min,两次收集上清，上清液过0.22^m无菌滤膜后分别稀释至2、4、8、16,32倍，取20^L发酵液采用牛津杯对峙法[26]观察抑菌效果.1.3田间试验方法1.3.1小麦播种试验于2020年11月16日一2021年4月15日在福建省南平市农业科学研究所试验基地进行.该基地为全国冬小麦国家区试赤霉病自然抗性鉴定点,赤霉病每年自然稳定发生,无需接种赤霉病菌.冬小麦于11月16日采用条播法播种,行距为26cm,畦宽1m,畦长20m，沟深30cm,基肥施用小麦专用复合肥900kg・hm-2、钙镁磷肥600kg・hm-2,播种后覆土并灌跑马水增加土壤湿度,保证小麦整齐出芽.灌水后立即施用丁草胺除草剂封闭除草，12月10日分蘖盛期施用二甲四氯钠防治双子叶杂草，12月25日人工培土除杂草，次年2月2日施用拔节肥.1.3.2试验设计共设置5个处理：（1）灌根，在小麦始穗期用拮抗菌株DY04的原液灌根处理一次；（2）穗部喷洒原液，分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒拮抗菌株DY04的原液（含助剂）各一次;（3）穗部喷洒发酵液，分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒拮抗菌株DY04的发酵液（含助剂）各一次；（4）农药对照，分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒60%戊唑多菌灵水分散粒剂（河北冠龙农化有限公司）各一次;（5）空白对照（CK）,分别在小麦始穗期、始花期和盛花期在穗部喷洒清水各一次.每个处理3次重复，共15个小区，每个小区20m2.穗部喷洒的拮抗菌原液（NB培养液培养）和发酵液（红糖豆粉培养液培养）有效成分含量为150000亿个・hm-2，灌根处理的有效成分含量为300000亿个・hm-2.1.3.3调查方法于小麦黄熟期病害稳定时采用5点取样法调查赤霉病发病情况.每点调查40穗，每小区调查200穗，记录小麦的病穗数和病小穗数，计算病穗率、病小穗率和防效，防效/%二（空白对照小区的病小穗率-处理小区的病小穗率）/空白对照小区的病小穗率x100[27].同时，于收获期调查有效穗数、每穗实粒数，测千粒重，计算理论产量和增产率.单位面积理论产量/（kg・hm-2）二平均每穗实粒数x千粒重（g）x每公顷有效穗数x10-3.1.4数据处理运用IBM SPSS Statistics19软件选择单因素方差分析处理数据.2结果与分析2.1菌落形态多粘类芽抱杆菌是一种革兰氏阳性菌,好氧或兼性厌氧生活⑻.显微镜（凤凰光学PH100-3A41L-EP）下观察到DY04菌体呈杆状，菌体大小为（0.5〜1.0）^mx（2.0〜8.0）^m,在PDA固体培养基上菌落呈白色透明、圆形,边缘整齐,表面湿润、光滑、微隆起（图1）.形态特征与多粘类芽抱杆菌相吻合.图1菌株DY04菌落(左)及菌体形态(右)(x1000)Fig.l Colony(left)and cell morphology(right)of strain DY04(x1000)・24・福建农林大学学报（自然科学版）第51卷2.216S rDNA序列比对结果菌株DY04的16S rDNA的序列长度为1490bp.经同源性鉴定，该菌株为类芽抱杆菌属（Paenibacil-lus）.由系统发育树（图2）可以看出，菌株DY04与Paenibacillus polymyxa（多粘类芽抱杆菌）聚为一个分支.结合形态特征,将其鉴定为多粘类芽抱杆菌.2.3菌株DY04的抑菌效果通过平板对峙法测定了菌株DY04对10种真菌的抑菌活性，结果（图3、表1）表明，该菌株对10种病原真菌均有不同程度的拮抗作用，表现出广谱抗病原真菌的特性.其中:对禾谷镰刀菌和稻瘟病菌的抑制率都达到80%以上;对茶拟盘多毛抱、番茄尖抱镰刀菌、灰霉病菌和玉米纹枯病菌的抑菌活性也较强，抑制率达到60%以上;对玉米平脐蠕抱的抑制率最低，为46.27%.94%]-----------------------------------------------------------------------Paenibacillusphoenicis NR108292.196%-----------Paenibacilluspolymyxa NR117732.2--------DY040.01图2菌株DY04的系统发育树图3菌株DY04对禾谷镰刀菌的抑制效果Fig.2Phylogenetic tree of strain DY04Fig.3Inhibitory effect of strain DY04on F.graminearum表1菌株DY04及其发酵液的拮抗谱i）Table1Antagonistic spectrum of strain DY04and its fermentation broth不同稀释倍数发酵液的抑菌效果病原真菌抑制率/%----------------------------------------------------2 4 81632禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)玉米平脐蠕抱(Bipolaris sp.)茶拟盘多毛抱(Pestalotiopsis theae)玉米茎点霉属(Phoma sp.)番茄尖抱镰刀菌(Fusarium oxysporum)香蕉枯萎病尖抱镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)黄萎病镰刀菌(Fusarium verticillium)灰霉病菌(Botrytis cinerea)玉米纹枯病菌(Rhizoctonia solani)稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)81.50±1.30a+46.27±2.92f+64.44±1.01bc+58.83±3.32de+63.83±2.52bcd+55.66±1.76e+57.44±1.57e+66.78±1.84b+60.11±1.26cde+81.55±1.83a+++++--++-++++++++-++-++-++-1）数据为各处理3个重复的平均值±标准差，数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著，附相同字母者表示差异不显著•+表示有抑菌效果,-表示无抑菌效果.2.4菌株DY04发酵液的抑菌效果采用牛津杯对峙法测定了菌株DY04发酵液对10种真菌的抑菌活性，结果（表1）表明：菌株DY04发酵液稀释至4倍时对10种真菌都有抑制作用;稀释至16倍时仅对禾谷镰刀菌、玉米茎点霉属、番茄尖抱镰刀菌和稻瘟病菌等4种真菌具有抑制效果.2.5施药方法对菌株DY04防治小麦赤霉病的影响表2显示,戊唑多菌灵对小麦赤霉病的防效最高，达到83.46%.多粘类芽抱杆菌菌株DY04的3种表2菌株DY04对小麦赤霉病的田间防治效果】）Table2Field control effect of strain DY04on head blight of wheat%处理病穗率病小穗率防效灌根92.5±2.04b12.22±4.82b58.43±4.63b穗部喷洒原液100.0±0.00c15.40±1.54b47.63±5.23c穗部喷洒发酵液97.5±2.88bc12.42±0.63b57.76±2.15b戊唑多菌灵57.5±5.40a 4.86±0.84a83.46±1.81a清水对照100.0±0.00c29.39±7.74c】）数据为各处理3个重复的平均值±标准差，数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著，附相同字母者表示差异不显著.第1期邓云:一株拮抗性多粘类芽抱杆菌的鉴定及其对小麦赤霉病的田间防效-25-施药方法中:灌根处理的防效最高，达到58.43%；穗部喷洒发酵液的防效次之，为57.76%；穗部喷洒原液的防效为47.63%.2.6菌株DY04施用方法对小麦产量的影响表3显示,小麦经3种方法施用多粘类芽抱杆菌菌株DY04后，穗实粒率、穗实粒数、千粒重与对照相比均有显著增加.灌根处理、穗部喷洒原液和穗部喷洒发酵液处理的千粒重分别比对照增加&83%、5.93%和7.21%；理论产量增产率分别为45.21%、25.29%和29.10%.表3菌株DY04施用方法对小麦产量的影响“Table3Effect of strain DY04application method on wheat yield处理有效穗数穗实粒率/%穗实粒数/粒千粒重/g理论产量kg•hm-2万个•hm-2灌根329.55±6.15a90.30±0.46b36.81±0.10b39.69±0.35ab4814.85穗部喷洒原液326.25±11.70a83.23±0.92d32.95±0.37c38.63±0.12c4154.25穗部喷洒发酵液324.90±6.30a85.87±0.45c33.69±0.56c39.10±0.36bc4280.55戊唑多菌灵326.10±3.75a95.70±0.83a40.03±0.33a40.00±0.37a5220.60清水对照326.55±9.75a71.27±0.96e27.85±0.59d36.47±0.61d3315.75 l)数据为各处理3个重复的平均值士标准差,数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著，附相同字母者表示差异不显著.3讨论多数研究者认为,多粘类芽抱杆菌为土壤中的活跃菌,容易在土壤中定殖和繁殖，在土壤的物资和能量循环中发挥重要作用，其代谢产物能够有效抑制病害；同时，该菌具有溶磷和固氮作用，能够增加土壤肥力和调节土壤微生态，促进植物生长,进而增强植物抵抗力[28-33].本试验中的多粘类芽抱杆菌DY04为土壤中筛选出的微生物菌.本研究表明,与穗部喷洒原液(防效为47.63%)或发酵液(防效为57.76%)相比,田间采用灌根方式施用多粘类芽抱杆菌DY04,对小麦赤霉病的防效较好，达58.43%.虽然在穗部施用时添加了保护剂等抗紫外线的助剂，且设置了连续施药3次的处理，但是防效持续性仍不够强，原菌及其代谢产物对紫外线敏感，且原菌不易定殖于植株穗部,导致穗部喷施的效果不及灌根处理.针对穗部喷药持效性弱的问题，今后可尝试炼化该菌的抗紫外线能力后进一步验证其持效性;灌根处理虽然防效较好，但与化学农药相比仍存在很大的差距,本试验中灌根处理只在抽穗初期进行了一次，今后可以通过在分蘖初期至扬花期增加灌根次数测试其是否能够提高药效，同时观察该菌在土壤中的定殖能力，为进一步分析其控制赤霉病发生的机理奠定基础.赤霉病菌会造成小麦穗部空瘪、籽粒发红发黑、千粒重低，从而降低结实率.本研究表明，与穗部喷洒原液或发酵液相比，灌根处理后小麦产量的增幅最大，千粒重比对照增加8.83%,理论产量增产率为45.21%.笔者田间观察发现，用多粘类芽抱杆菌DY04灌根处理后，灌浆期小麦籽粒外壳部分虽然有红褐色病斑,但后期受到控制并未影响内部健康籽粒；而穗部喷洒原液或发酵液后,灌浆后期外壳带菌麦粒并不能被有效控制，赤霉病菌仍向内部发展,从而降低了籽粒品质.有关灌根处理对小麦赤霉病的防治机理值得深入研究.致谢:衷心感谢苏妍、黄继平、洪红升、葛桂梅、刘友等同事对该试验给予的帮助.参考文献[1]李正辉，向晶晶,陈婧鸿，等.小麦赤霉病拮抗菌的分离与鉴定[J].麦类作物学报,2007,27(1):149-152.[2]韩青梅，曹丽华.小麦赤霉病的生物防治研究进展[J].麦类作物学报,2003,23(3):128-131.[3]成丽霞，彭兵，李天金，等.一株具有广谱抗真菌活性细菌菌株的分离鉴定及拮抗物的理化特性[J].微生物学通报,2009,36(3):365-370.[4]STURZ A V,CHRISTIE B R,N0WAK J.Baterial endophytes：potential role in developing sustainable systems of crop production[J].Critical Reviews in Plant Sciences,2000,19(1):1-30.[5]刘珂欣，辛寒晓,范学明，等.多粘类芽抱杆菌的固态发酵工艺及其对水稻恶苗病的防治作用[J].山东农业科学,2018,50(10):105-111.[6]何斐,张忠良，崔鸣，等.生防放线菌剂对魔芋根域微生物区系的影响[J].应用与环境生物学报,2015,21(2):221-227.・26・福建农林大学学报(自然科学版)第51卷[7]SALME T,NINA G,GERHART E H,et al.Paenibacillus polymyxa invades plant roots and forms biofilms[J].Appl EnvironMicrobl,2005,71(11)：7292-7300.[8]田宇曦，闵勇，杨自文，等.多粘类芽抱杆菌研究进展[J].湖北农业科学,2017,56(18):3401-3404,3409.[9]李舒清.多粘类芽抱杆菌SQR-21中fus基因簇特征研究及基因组分析[D].南京:南京农业大学,2013.[10]张楠,陈岩,王丽丽，等.多粘类芽胞杆菌对植物土传病害的防控及促生长作用研宄进展[J].微生物学杂志,2017,37(5):91-97.[11]LIN M Z,JIN M F,XU K,et al.Phosphate-solubilizing bacteria improve the phytoremediation efficiency of Wedelia trilobatafor Cu-contaminated soil[J].Int J Phytoremediation,2018,20(8):813-822.[12]RAZA W,YANG W,SHEN Q R.Paenibacillus polymyxa:antibiotics,hydrolytic enzymes and hazard assessment[J].Journal of Plant Pathology,2008,90(3):419-430.[13]孙光忠，刘元明,彭超美，等.多粘类芽抱杆菌对小麦赤霉病田间防治效果研究[J].农药科学与管理,2016,37(7):45-47.[14]刘振华，井长勤,周晨妍，等.生防细菌多粘类芽抱杆菌多糖研究进展[J].上海农业学报,2015,31(4):146-150.[15]王刘庆，王秋影,廖美德，等.多粘类芽抱杆菌生物特性及其机理研究进展[J].中国农学通报,2013,29(11):158-163.[16]CH0IS K,PARX S Y,KIMR,et al.Identification and functional analysis of the fusaricidin biosynthetic gene of Paenibacilluspolymyxa E681[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,365(1)：89-95.[17]KIM S G,JE0N Y H.A plant growth promoting rhizobacterium,Paenibacillus polymyxa strain GBR-1,suppresses root-knotnematode[J].Bioresour Technol,2008,99(8):3016-3023.[18]张亮，盛浩，袁红，等.多粘类芽抱杆菌LRS-1对辣椒疫霉病害根际土壤细菌多样性的影响[J].土壤通报,2020,51(2):358-363.[19]LI X Z,RUI J,XI0NG J B,et al.Functional potential of soil microbial communities in the maize rhizosphere[}/0L].PLoS0NE,2014,9(11):el12609[2021-06-03].https：///ehosMpdfviewer/pdfviewer?vid=1&sid= 565c0ef2-b483-4fef-b49d-a2b81ed8eefe%40redis.[20]WANG Q,MA Y,WANG G,et al.Integration of biofumigation with antagonistic miroorganism can control Phytophthora blightof pepper plants by regulating soil bacterial community structure[J].European Journal of Soil Biology,2014,61(5):58-67. [21]金美芳，丁可武,林茂兹，等.多粘类芽抱杆菌S960抑制尖抱镰刀菌的活性物质分离纯化[J].安徽农业大学学报,2020,47(5):798-804.[22]林茂兹，金美芳，邹虹.多粘类芽抱杆菌S960菌株发酵条件优化[J].福建师大福清分校学报,2015(5)：6-11.[23]李妮,李明雄，雷润，等.多粘芽抱杆菌属孔雀绿脱色菌产脱色酶的条件研究[J].四川大学学报(自然科学版)，2009,46(6):1882-1886.[24]王剑，王楠，高观朋，等.200亿芽抱/g枯草芽抱杆菌可湿性粉剂的研制[J].农药,2010,49(7)：486-489.[25]邓云，江文清，苏妍，等.利用感染赤霉病菌的大麦粒诱导分离土壤中拮抗菌的方法:202010365702.5[P].2020-05-18.[26]宫安东.镰刀菌和黄曲霉生防菌的分离及拮抗机理研究[D].武汉:华中农业大学,2015.[27]农业部农药检定所生测室.农药田间药效试验准则(三)[M].北京：中国标准出版社,2004:161-164.[28]周涛，满文曾,吴晓营，等广谱抑菌性多粘芽抱杆菌的筛及其细菌素理化特征[J].食品工业科技,2019,40(24):99-103.[29]申顺善，张涛，王娟，等.多粘类芽抱杆菌HK18-8对辣椒炭疽病菌的抑制作用及其定殖能力[J].园艺学报,2019,46(3)：499-507.[30]李鹏翔，王莘，刘瑞军.一株拮抗人参灰霉病菌和黑斑病菌的细菌鉴定[J].吉林农业大学学报,2013,35(5)：516-519.[31]张淑梅，沙长青,赵晓宇，等.一株抗真菌内生多粘芽抱杆菌的分离鉴定及对水稻恶苗病菌的抑制作用[J].中国生物工程杂志,2010,30(2)：84-88.[32]王笑颖，孟成生，雷白时.大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽抱杆菌7-4菌株的筛选与鉴定[J].湖北农业科学,2011,50(9)：1797-1800.[33]张忠良，刘东平,潘培培，等.多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)K18-5不同悬浮液处理对黄瓜枯萎病抑制作用的影响[J].河南农业大学学报,2019,53(5)：724-730.(责任编辑:杨郁霞)。
一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定
30(4)489-496 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2014年8月一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定郭芳芳1,2，谢镇3，卢鹏1，郭岩彬4，张立钦2，王勇军1,2*（1. 浙江农林大学林业与生物技术学院，临安311300；2. 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室，临安311300；3. 浙江省桐庐县林业局，桐庐311500；4. 中国农业大学资源与环境学院，北京100193）摘要：菌株CF05是从浙江天目山柳杉中分离得到的1株细菌，经形态、16S rDNA序列、生理生化指标检测，鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa。
平板拮抗结果表明，该菌对9种植物病原真菌和3种病原细菌具有显著拮抗效果。
室内生测结果表明，发酵液和菌悬液对番茄幼苗均具有明显的促生效果，其中发酵液处理最佳，鲜重增长272.0%，干重增长266.7%。
菌株CF05接种27 d后，番茄根际细菌浓度仍很高。
种子萌发测定结果表明，菌株CF05处理后发芽率提高11.7%，番茄猝倒病防治测定结果显示，发病率降低38.6%，效果均优于Bacillus subtilis 168处理。
综上结果，表明P. polymyxa CF05是1株生防性状优良的促生细菌。
关键词：多粘类芽孢杆菌；生物防治；促生；番茄猝倒病中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2014)04-0489-08Identification of a Novel Paenibacillus polymyxa Strain and Its Biocontroland Plant Growth-Promoting EffectsGUO Fangfang1,2, XIE Zhen3, LU Peng1, GUO Yanbin4, ZHANG Liqin2, WANG Yongjun1,2*(1. College of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, China; 2. National Joint Engineering Laboratory of Biopesticide Preparation, Lin’an 311300, China; 3. Tonglu Forestry Bureau of Zhejiang Province, Tonglu 311500, China; 4. College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094, China)Abstract: Strain CF05 isolated from Cryptomeria fortunei in Tianmu Mountain, Zhejiang province was identified as Paenibacillus polymyxa on the bases of its phenotypical and biochemical characteristics as well as 16S rDNA gene sequence. The P. polymyxa CF05 exhibited highly antagonistic effects against 9 plant fungal pathogens and 3 plant bacterial pathogens in vitro. Furthermore, both cell-free fermentation and bacterial suspension promoted tomato seedlings growth in greenhouse assay. Cell-free fermentation increased the biomass with fresh weight and dry weight by 272.0% and 266.7%, respectively. It was demonstrated that secondary metabolites from this bacterium might perform a critical function in plant growth promotion. Tests of root-colonizing ability indicated that concentrations of the bacterium in tomato rhizosphere were 3.8, 3.6, 3.1 and 3.1 log CFU/g root after 27 days of inoculation of tomato seeds with the bacterial suspension at 108、107、106、105 CFU/mL, respectively. Seed germination ratio was increased by 11.7%, and the disease incidence of damping-off was reduced by 38.6% after seed treatment.Key words:Paenibacillus polymyxa; biological control; plant growth promotion; tomato damping-off disease多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa是一类具有广泛宿主的根际促生菌，对真菌、细菌、线虫等引起的植物病害具有防治效果。
多粘类芽孢杆菌菌落特征
多粘类芽孢杆菌菌落特征
多粘类芽孢杆菌是一种常见的细菌，其菌落特征多种多样，可以通过观察细菌培养基上的菌落形态、大小、颜色等方面进行鉴定。
下面是多粘类芽孢杆菌的菌落特征的详细介绍。
1. 大小
多粘类芽孢杆菌的菌落大小一般为1-3毫米，但也有些菌株的菌落可能更大。
2. 形态
多粘类芽孢杆菌的菌落形态一般呈圆形、半圆形或不规则形，边缘一般光滑。
3. 颜色
多粘类芽孢杆菌的菌落颜色因菌株不同而有所差异，常见的颜色有白色、乳白色、黄色、灰色、褐色等。
其中，黄色菌落常常被用于检测蛋白质的表达。
4. 质地
多粘类芽孢杆菌的菌落质地通常比较粘稠，而且触感略带黏滑。
5. 材质
多粘类芽孢杆菌的菌落通常呈松散状，很难凝聚成实体。
6. 能力
多粘类芽孢杆菌是一种产胶菌，其菌落表面常常含有大量胶质。
在某些菌株中，胶质甚至会侵入培养基内部。
7. 散发气味
多粘类芽孢杆菌的菌落通常散发出一股淡淡的气味，有些菌株的气味甚至类似于芽孢杆菌。
芽孢杆菌的检测方法
芽孢杆菌的检测方法韩雪;张兰威【摘要】内生芽孢是目前所知的最具抗性的生命活体结构.它对许多处理(包括热、紫外线)都有很强的抗性,这与它的特殊结构有关.这种特性使其能经巴氏杀菌而残存于乳中,因此把芽孢数及耐热芽孢数、嗜冷菌作为原料奶检验项目之一,能较全面地评判原料奶的质量.根据芽孢的特性,本文对目前芽孢检测的各种方法进行了综述,以期为芽孢的快速检测提供依据.【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2007(028)001【总页数】4页(P347-350)【关键词】芽孢;原料乳;检测;2,6-吡啶二羧酸【作者】韩雪;张兰威【作者单位】东北农业大学食品学院,黑龙江,哈尔滨,150030;哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院,黑龙江,哈尔滨,150086【正文语种】中文【中图分类】工业技术347※专题论述食品科学2007, Vol.28, No.01[51]ANDREWS L S, PARK D L, CHEN Y P.Low temperature pasteuriza- tiontoreducetheriskofVibrioinfectionsfromrawshell-stockoysters[J].FoodAdditives andContaminants, 2000,19(7): 787.[52]CALIK H,MORRISSEY M T, RENO P, et al.Effect of high-pressure processing onVibrioparahaemoly ticusstrainsin pureculture and芽孢杆菌的检测方法韩雪1，张兰威2,*(1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030 ；2.哈尔滨工业大学食品科学与遗传工程研究院，黑龙江哈尔滨150086)摘要：内生芽孢是目前所知的最具抗性的生命活体结构。
它对许多处理(包括热、紫外线)都有很强的抗性，这与它的特殊结构有关。
海洋多粘类芽孢杆菌L1-9菌株发酵液抗菌谱及稳定性测定
Ａｎｔ ｉ ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂｉ ａ ｌ ｓ ｐｅ ｃ ｔ ｒ ｕｍ ａ ｎ ｄ ｓ ｔ ａ ｂｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏｒ ｍａ ｒ ｉ ｎ ｅ
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大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽孢杆菌7-4菌株的筛选与鉴定
大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽孢杆菌7-4菌株的筛选与鉴定摘要:为筛选对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)具有拮抗作用的芽孢细菌,采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株,再对其进行复筛,得到1株具有较强抑菌活性的拮抗细菌7-4菌株,并对该菌株进行了形态特征观察和生理生化鉴定,初步判断其为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)｡关键词:大丽轮枝菌;拮抗细菌;筛选;鉴定;多粘芽孢杆菌Screening and Identification of Antagonistic Bacterium Strain 7-4 against Verticillium dahliaeAbstract:In order to obtain antagonistic bacteria against Verticillium dahliae, 84 antagonistic strains were isolated from the soil in different areas and screened by improved agar plate diffusion method. The antagonistic activity against V. dahliae of strains were tested via secondary screening. As a result, a strain called 7-4 which had strong inhibition capability against V. dahliae was obtained. According to morphological and culture characters, physiological and biochemical experiments,the strain 7-4 was preliminarily identified as Bacillus polymyxa.Key words: Verticillium dahliae; antagonistic bacteria; screening; identification; Bacillus polymyxa棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的一种真菌性病害,此病原菌首先于1914年在美国的弗吉尼亚州被发现,随后蔓延到世界上其他的产棉国,1935年传入中国[1]｡目前,棉花黄萎病已经蔓延到全国各产棉区,并造成严重的经济损失,防治难度较大,至今尚无特效的防治药剂,已成为棉花生产的主要障碍之一｡现阶段只能依靠以种植抗病品种为主的综合防治措施,但由于高抗黄萎病的棉花品种少,且对大丽轮枝菌致病的机理以及棉花抗黄萎病的遗传方式了解还比较少｡因此,在目前缺乏有效抗源的情况下,生物防治将是一种重要的辅助防治手段[2]p 1.2培养基NA培养基､NB培养基､马铃薯培养基(PDA)成分及制备参见文献[7],生理生化鉴定培养基制备及试剂参照文献[8]｡1.3试验方法1.3.1土样采集从邢台､保定､唐山､邯郸､沧州等地的棉田中取10~15 cm深处土样,风干后,保存于牛皮纸袋中｡记录采样时间､地点等信息｡1.3.2土壤中芽孢细菌的分离纯化取土样1.0 g研细,加入装有9.0 mL无菌水的试管中摇匀,80 ℃水浴30 min,然后取1.0 mL进行10倍梯度稀释至10-6,分别取10-4､10-5､10-6 3个梯度的稀释液0.1 mL涂布在NA培养基平板上,37 ℃倒置培养24 h｡挑取形态､大小､色泽不同的单菌落分别转接至NA斜面上,并分别进行菌株编号,37 ℃培养24 h,置于4 ℃冰箱保存备用[9]｡同时采用平板划线法检测每株菌的纯度｡1.3.3大丽轮枝菌混菌平板的制备向培养10 d左右的大丽轮枝菌斜面加5.0 mL 无菌水,用接种环轻轻刮取斜面上的孢子,摇匀,形成孢子悬液｡再将孢子悬液加入融化后冷却到50 ℃左右的PDA培养基中,迅速摇匀,倒平板,凝固待用｡1.3.4大丽轮枝菌拮抗细菌的初筛取制备好的大丽轮枝菌混菌平板,用接种环从分离到的细菌斜面上挑取少许菌体点种在PDA平板上,24℃培养3 d,挑选出有抑菌圈的拮抗菌株备用｡1.3.5大丽轮枝菌拮抗细菌的复筛将初筛获得的拮抗细菌活化后接种于装有50 mL NB培养基的250 mL三角瓶中,于30 ℃､180 r/min摇床上振荡培养48 h｡在制备大丽轮枝菌混菌平板时,向培养基中加入终浓度为0.25 μg/mL链霉素,放冷后,用打孔器打出一定数量均匀的孔,分别向每孔中加入70 μL培养48 h的拮抗细菌发酵液上清,静置30 min,24 ℃培养3 d｡测量抑菌圈直径,挑选出抑菌圈大且清晰的菌株[10]作为目的菌株,用于后续试验｡1.3.6菌株的形态特征观察采用稀释涂平板法将适当浓度的目的菌株菌悬液涂布在NA平板上,静置30 min,37 ℃倒置培养24 h,观察菌落形态特征｡从37 ℃培养24 h的斜面上挑取少量目的菌株的菌体进行革兰氏染色和芽孢染色,染色方法参见文献[8],显微镜下观察其菌体和芽孢形态｡1.3.7菌株的生理生化鉴定根据《常见细菌鉴定手册》[8]及《伯杰细菌鉴定手册》[11]中相应属､种鉴定有关的内容,选取了以下生理生化试验对目的菌株进行鉴定:V.P试验､酪素水解试验､硝酸盐还原试验､吲哚试验､淀粉水解试验､过氧化氢酶试验､硫化氢产生试验､糖发酵试验､柠檬酸盐试验､甲基红试验､耐盐试验､酪氨酸水解试验｡2结果与分析2.1拮抗细菌的初筛结果从土样中共分离得到400余个菌株,经初筛获得84株拮抗菌株,其中有18株产生的抑菌圈直径较大､抑菌能力较好(表1)｡2.2拮抗细菌的复筛结果将初筛获得的拮抗能力较好的18株菌株进行复筛,其中4株拮抗菌株(4-59､7-4､8-54､12-23)的发酵液上清液表现拮抗活性｡对复筛得到的4株拮抗细菌所分泌的拮抗物质进行抗菌活性的比较,结果发现7-4菌株的无菌拮抗物质溶液对大丽轮枝菌表现的拮抗活性最高(表2,图1)｡2.37-4菌株的菌落特征7-4拮抗菌株在NA平板上单菌落呈圆形,边缘整齐,不透明,乳白色,表面微有皱褶,不光滑,呈馒头状(图2)｡2.47-4菌株的菌体特征7-4菌株细胞经染色后在显微镜下观察呈杆状,革兰氏染色呈阳性,菌体大小为0.7~0.8 μm×2.0~3.0 μm;可形成内生芽孢,芽孢囊明显膨胀,芽孢椭圆形､中生到次端生､稍膨大(图3)｡2.57-4菌株的生理生化鉴定结果7-4菌株的生理生化鉴定结果见表3｡结合7-4菌株的形态特征和生理生化特征综合考察,根据《伯杰细菌鉴定手册》[11]初步判断其为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)｡3讨论试验中某些初筛活性很高的菌株进入复筛后,其抑菌活性明显降低,甚至消失,这可能是由于抑菌机制不同(比如营养竞争与分泌抗菌素),或者是培养条件不合适所导致的,如果换用其他培养基或优化培养基配方,应该还可以获得抑菌效果不错的菌株｡事实也证明当适当改变培养基配方时,以前抑菌活性较弱的菌株其抑菌活性有明显提高,这也表明发酵条件对拮抗物质的产生具有重要影响｡本试验复筛是采用摇瓶发酵,再用其发酵液上清进行抑菌活性检测,因此本试验复筛获得的4株拮抗细菌产生的抑菌物质可以认为是胞外产物,而且产生的抑菌圈在室温放置一个月后,抑菌圈中仍无病原菌长出,说明其性质比较稳定｡其后对其进行了鉴定,发现这些抑菌物质均为蛋白(或多肽),因此在后续的研究中,可以进行发酵条件的优化､拮抗多肽的分离纯化､蛋白多肽的基因克隆等｡生物防治作为棉花黄萎病最有前景的防治方法之一,在防治棉花黄萎病,最大限度地降低该病害造成的损失,提高棉花生产的经济效益和社会效益方面具有重大意义｡芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一,由于其抗逆性强,抗菌谱广泛,对多种病原真菌､细菌均有较强的抑制作用,而引起研究者的广泛关注｡目前,生防研究所涉及的芽孢杆菌种类主要有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)､多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)､蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)､地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等[12-15]｡因此,本试验主要是针对产芽孢细菌进行筛选,这样便于菌剂商品的保存,也可以使试验成果更便捷地在农业生产中应用｡参考文献:[1] 张发华. 棉花枯黄萎病传播途径及综合防治技术[J].中国棉花,2006,33(4):31-32.[2] 简桂良,卢美光,仇家山,等. 棉花黄萎病防治策略[J]. 中国植保导刊,2004,24(4):30-31.[3] 王光华,RAAIJMAKERS J M. 生防细菌产生的拮抗物质及其在生物防治中的作用[J]. 应用生态学报,2004,15(6):1100-1104.[4] 周艳芬,杜红方,袁洪水,等. 棉花黄萎病拮抗蛋白的分离与纯化[J]. 棉花学报,2007,19(2):98-101.[5] 袁洪水,马平,李术娜,等. 棉花黄萎病拮抗细菌的筛选与抗菌物分析[J]. 棉花学报,2007,19(6):436-439.[6] 孙瑶,马平,朱宝成,等. 棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究[J]. 华北农学报,2006,21(6):119-123.[7] 陈金春,陈国强. 微生物实验指导[M].北京:清华大学出版社,2005. 8.[8] 东秀珠,蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社,2001.[9] 范秀容,李广武,沈萍. 微生物学实验[M]. 北京: 高等教育出版社,1989.[10] 李术娜,杜红方,袁洪水,等. 棉花黄萎病拮抗细菌LC-04菌株的抗菌蛋白产生条件研究[J]. 棉花学报,2006,18(4):233-237.[11] 布坎南R E,吉本斯N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 第八版.北京:科学出版社,1984.[12] 郝华昆,韩俊华,李为民,等. 棉花黄､枯萎病拮抗菌株B110的鉴定及其抑菌作用方式[J]. 植物保护学报,2007,33(2):77-80.[13] 裴炎,李先碧,彭红卫,等. 抗真菌多肽APS-1的分离纯化与特性[J]. 微生物学报,1999, 39(4):344-349.[14] CHARLES B, DOROTHY H, MAURICE S. Control of toxic endophytic fungi of corn, tall fescue and other grasses[J]. Toxicology and Mycotoxin Research,2005,95(6):55.[15] 陶然,杨朝晖,曾光明. 微生物絮凝剂产生菌的筛选､鉴定及培养条件和工艺的优化研究[D]. 长沙:湖南大学,2006.。
芽孢菌的检测方法
芽孢菌的检测方法芽孢菌是一类存在于自然界中的广泛分布的菌群，包括了许多不同的菌种，常见的有大肠杆菌芽孢、肠球菌芽孢、枯草芽孢等。
芽孢菌具有极强的耐热性，对极端温度、辐射、腐蚀性化学物质等都具有强大的抵抗能力。
芽孢菌对人体健康和环境卫生都可能构成威胁，因此进行芽孢菌的检测就显得十分的重要。
芽孢菌的检测方法可以分为文化检测法和分子检测法。
文化检测法是从样品中分离出目标微生物，然后在培养基上生长形成菌落，进行形态学、生理学和生化学特性分析，以确认该菌种的身份。
分子检测法利用种特异性的DNA序列来鉴定目标菌株，具有快速、高灵敏度、高特异性等特点。
下面针对这两种方法进行阐述。
一、文化检测法文化检测法是较为传统且经典的检测方法，可以分为传统培养法和快速培养法两种方法。
1. 传统培养法传统培养法将待测样品在富含营养成分的培养基上进行孵育，利用菌落分离、形态学和生物化学特性判断目标微生物。
具体步骤如下：（1）取样品：根据采样点、采样环境和采样目的选定待测样品，例如空气、土壤、水等。
（2）处理样品：将不同的样品送至实验室，按照规定方法对其进行处理。
例如，对于土壤样品，可以在高温高压釜中进行湿热处理使其杀灭菌种，然后进行制样；对于水样，可以利用滤膜等方式过滤样品。
（3）制备培养基：根据目标微生物的生长要求选择合适的培养基，例如，Baird-Parker琼脂、霍乱沙门氏培养基等。
并按照指导书制备好培养基。
（4）接种菌株：使用胶体滴液、均质法和洒撒法等方法将样品接种于上述培养基上。
（5）菌种分离和鉴定：检测培养基上的菌落，判断其形态学和生物学特性，进行菌株分类和鉴定。
2. 快速培养法快速培养法是在传统培养法基础上发展而来，主要是对富含营养成分的培养基、孵育条件、化学识别等方面进行改良，以提高芽孢菌检测的效率和准确性。
快速培养法的这些改良措施包括：（1）改良培养基：利用大量的营养素、激素等促进菌种的生长繁殖。
（2）改良孵育条件：使用温度、湿度、气体组成等环境条件进行调整，加速菌种的生长繁殖。
芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
目的：建立芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：QC内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、吐温80等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入30ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，再加入60ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动30min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×101稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3 用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液1ml，加至已灭菌的平皿中，再加入50℃左右的培养基，向每个培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后，倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数： 5.1 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
5.3若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数。
多粘类芽孢杆菌 (1)
多粘类芽孢杆菌1.基本特性1.1中文通用名称：多粘类芽孢杆菌1.2英文通用名称（或拉丁名称）：Paenibacillus polymyxa1.3毒性：低毒1.4应用作物：棉花、玉米、水稻、花生、马铃薯、黄瓜、青椒1.5防治对象：棉花黄萎、黑根腐、炭疽病、赤霉病；玉米全蚀病；水稻白叶枯病；花生青枯病；马铃薯软腐病；黄瓜角斑；青椒疮痂1.6生防特点：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对植物黄萎病、鹰嘴豆枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害均具有一定的控制作用。
美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一。
无论是采用HY96-2（P. polymyxa）发酵液，还是由HY96-2制成的细粒剂(KDLD)，在温室内和田间都取得了稳定的防治效果，并且KDLD细粒剂在田间表现的效果更为突出。
2.定性鉴别试验2.1菌株的形态及培养特征类芽孢杆菌属。
菌株接种于 LB固体培养基上，28ºC培养 18～24 h，观察其菌落形态。
利用光学显微镜观察在LB培养基上生长菌体形状和革兰氏染色情况，利用电镜观察菌体大小、荚膜和鞭毛着生情况。
菌体大小为(0．6～ 0．8) μm ×(2．0～5．0) μm，革兰氏阳性、阴性或可变，兼性厌氧，杆状，产芽孢，芽孢椭圆形，端生，膨大，有荚膜，鞭毛侧生或周生。
在 PDA平板上，菌落较小、白色或淡黄色、圆形、菌面稍凸或不凸起，边缘整齐，表面有光泽、光滑、湿润、半透明到不透明；在肉汁琼脂培养基上生长菌落较薄，无菌膜，液体澄清；在斜面培养基上生长良好，菌苔线状、扁平，表面光滑、半透明。
最适合生长温度30-35 ºC表1 菌株在不同培养基中的培养特征（30ºC ，2天）培养特性LB琼脂营养琼脂酵母浸膏琼脂牛肉汁琼脂菌落颜色乳白色杏仁白色淡黄白色灰白色菌落形状湿润光滑粘稠状有小突起，粘性湿润光滑菌落直径mm 2.5 2.8 3 2.62.2生理生化特征由表2可知，菌株的接触酶、厌氧生长、酪朊水解、淀粉水解、V—P反应和硝酸盐还原均为阳性；氧化酶、酪氨酸水解、脲酶、卵黄卵磷脂水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D葡萄糖、D一木糖、D一甘露醇、甘油，且均产酸、产气。
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多粘芽孢杆菌检测方法
一、检测用培养基配方与培养条件
1.培养基：酵母浸膏培养基
配方：蔗糖：1.0%
酵母浸膏：0.45%
KH2PO4:0.05%
MgSO4：0.05%
NaCl：0.05%
琼脂粉：2%--2.5%
PH：7.2--7.4
2. 培养条件：温度：33℃-37℃；时间：24--30小时。
二、检测与计数方法
1. 系列稀释
取250ml锥形瓶一个，加入适量玻璃珠，100ml无菌水，3滴吐温80（分散剂：分散菌团用），塞上棉塞并放入到70℃水浴锅中预热，待锥形瓶中水温达到70℃后，称取适量样品加入锥形瓶中，摇匀，70℃水浴20分钟。
水浴结束后迅速冷却到30—40℃左右，上旋转式摇床200 r/min充分振荡40 min，即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。
3. 加样及培养
取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1ml (菌悬液加入量)，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。
此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别
根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。
当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
5. 菌落计数
以出现20—300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。
有效菌平均菌落数（x）在20—300之间时，则以该菌落数计算。
有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：
nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1）
式中：
nm —质量有效活菌数，亿/g
nv —体积有效活菌数，亿/mL
x—有效菌落平均数，个
k —稀释倍数
v1—基础液体积， mL
v2—菌悬液加入量， mL
v0—样品量， mL
m0—样品量， g
重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。
所以：
①悬液中要加分散剂分散菌团；
②水浴热处理一方面杀死营养体，另一方面加快分子热运动进一步分散菌团；
③震荡时间也要较液态发酵产品时间长，使用旋转式摇床控制在180——
200r/min 。
（往复式摇床的震荡处理一样，若有菌悬液溅起，可用保鲜膜事先将棉塞包裹一下，以便溅起的部分液滴迅速流回悬液中。
）
④水浴后迅速冷却。
先水浴，后震荡。