多粘芽孢杆菌产甘露聚糖酶的发酵条件研究

目录摘要 (II)关键词 (II)Abstract ....................................................................................................................................... I II Key words ................................................................................................................................... I II 引言 . (1)1 材料与方法 (1)1.1 实验材料 (1)1.1.1 菌种 (1)1.1.2 主要仪器设备 (1)1.1.3 药品、试剂及配制 (2)1.2 实验方法 (3)1.2.1 培养基及条件 (3)1.2.2 粗酶液的制备 (3)1.2.3 酶活的定义 (3)1.2.4 酶活的测定 (3)2 实验结果 (3)2.1 产酶培养基的优化 (3)2.1.1 碳源的优化 (3)2.1.2 氮源的优化 (4)2.1.3 磷酸二氢钾浓度的优化 (5)2.1.4 硫酸镁浓度的优化 (6)2.1.5 发酵产酶培养基的正交实验 (6)2.2产酶条件的优化 (7)2.2.1 温度对产酶的影响 (7)2.2.2 接种量对产酶的影响 (8)2.2.3 pH对产酶的影响 (8)2.2.4 转速对产酶的影响 (9)3 结果与分析与展望 (9)参考文献 (11)致谢 (11)多粘芽孢杆菌产甘露聚糖酶的发酵条件研究摘要β-甘露聚糖是自然界中广泛存在的一类半纤维素。

β-甘露聚糖酶可以水解葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖以及甘露聚糖等一大类半纤维素，形成能被较好利用的低聚糖。

半纤维素被彻底分解且不造成污染的一条有效的途径，就是利用酶的水解作用。

本文以多粘芽孢杆菌为菌种，对多粘芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶发酵工艺条件进行了研究。

通过单因素及正交试验优化分别从培养基和培养条件两方面，考查了不同因素对菌株发酵产酶的影响。

主要研究结果如下：菌株产酶最佳培养基组成为（g/L）：2.25%魔芋粉+1.25%酵母膏+0.15%MgSO4·7H2O +0.3%K2HPO4·3H2O。

产酶最适培养条件为：初始pH值9.0，接种量为6 %，摇床转数220 rpm，33℃振荡培养28h可达到产酶高峰。

关键词β-甘露聚糖酶；发酵条件；多粘芽孢杆菌；正交优化The study of fermentation conditions of produci ng β-mannanaseby bacillus polymyxaAbstractβ-mannan,a class of hemicellulose, exist widely in the nature. β-mannanase can hydrolyze grape mannan,galactomannan, glucomannan,and galactomnnan mannose such a large class of hemicellulose, the formation of oligosaccharides can be better utilized. Hemicellulose was completely decompose without polluting an effective ay is to use enzyme hydrolysis. In this paper, making bacillus polymyxa as the bacteria, studies fermentation conditions of producing β-mannanase by bacillus polymyxa.Form culture conditions and culture time,examines the different factors’ influences on the strains fermentation, by single factor and orthogonal experimental design The main finding are as follows:The fermentation conditions were optimized in order to improve the production of the enzyme: 2.25% konjac + 1.0% yeast extract +0.15% MgSO4·7H2O+ 0.3%K2HPO4·3H2O; The optimal culture conditions for β-mannanase were initial pH 9.0, inoculation volume6%, agitation speed 240 rpm. After incubation at 33℃ , the enzyme showed the highest activity.Key wordsβ-mannanase; fermentationconditions; Bacillus polymyx ; orthogonal optimization引言β-甘露聚糖酶(β-1, 4-D-mannan mannanohyd-rolase；EC 3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等，能消除甘露聚糖对单胃动物各种营养素的抗营养作用[1]。

β-甘露聚糖酶存在于一些低等动物的肠道分泌液中，豆类植物如四棱豆，长角豆等萌发的种子中，天南星科植物魔芋萌发的球茎中都发现了酶活性的存在[2]。

而微生物更是产生β-甘露聚糖酶的主要来源，且具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等明显优点[3]。

自1958年Counios第一次报道了能产生β-甘露聚糖酶的真菌后，不少学者投入到β-甘露聚糖酶的研究中去。

从事的方面有产酶菌株的筛选[4-9]、基因诱变[10-13]，酶晶体结构分析[14]，分子生物学结构分析[15]以及培养基成分与条件的优化[16-18]等都取得了突破性成果。

其中以培养基和培养条件优化的研究最为激烈。

随着近年来对自然界半纤维素资源的大力开发和甘露低聚糖药用价值[19,20]等其他价值的发现，β-甘露聚糖酶也越来越受重视。

针对β-甘露聚糖酶的基础研究也进入一个新高潮，其在人类生活中的应用越来越广泛。

β-甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，具有多种生物学功能。

β-甘露聚糖酶可以用于糖链结构的分析，造纸工业，纺织工业，石油工业和饲料工业等。

如在饲料工业中[21-25]甘露聚糖酶主要作为外源性酶参与机体活动。

另外，随着抗生素带来的农药残留问题，甘露聚糖和甘露聚糖酶对动物健康和生产性能的促进作用某种程度上已成为抗生素的替代产品。

β-甘露聚糖酶有着广阔的应用价值和前景，这是人们一直不懈地探索研究β-甘露聚糖酶巨大推动力。

但由于β-甘露聚糖酶活性水平普遍较低，限制了其在实际生产中的应用，且对于多粘芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的研究较少。

本研究以多粘芽孢杆菌为生产菌株，通过具体实验研究对多粘芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的培养条件和培养基成分进行优化设计，并到实验结果。

1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌种多粘芽孢杆菌武汉生物工程学院发酵实验室提供1.1.2 主要仪器设备数显恒温水浴锅HH-2 国华电器有限公司电子万用炉北京市永光明医疗仪器厂SPX—150B—Z型生化培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂手提式不锈钢蒸汽消毒器YX280A 上海三申医疗器械有限公司HQ45Z恒温摇床武汉中科科仪技术发展有限责任公司202—0B型电热恒温干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司BSC—1300ⅡA/B3 生物洁净安全柜上海博讯实业有限公司医疗设备厂笔式PH计0.1级杭州市奥立龙仪器有限公司电子天平（max120g）北京赛多利斯仪器系统有限公司80—Bl离心机常州国华电器有限公司TU—1810紫外可见分光光度计北京市普析通用仪器有限责任公司1.1.3 药品、试剂及配制1.1.3.1 药品与试剂魔芋粉、麸皮从市场购买马铃薯淀粉、酵母膏、胰蛋白胨北京市奥博星生物技术有限公司葡萄糖湖南湘大化工试剂有限公司乳糖、氯化钠、无水亚硫酸钠、乙冰酸天津市博迪化工有限公司硝酸铵、硫酸镁、硫酸铵洛阳市化学试剂厂尿素、酒石酸钾钠天津市化学试剂三厂牛肉浸膏天津市英博化学试剂有限公司磷酸氢二钾天津石英中厂霸州市化工分厂乙酸钠、苯酚武汉市江北化学试剂有限责任公司3，5—二硝基水杨酸浙江湖州食品化工联合公司氢氧化钠天津市风船化学试剂科技有限公司磷酸二氢钾中国中湘地质实验研究所琼脂粉上海山浦化工有限公司甘露糖国药集团化学试剂有限公司1.1.3.2 药品配置（1）DNS试剂配置称取182g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水中，45℃下溶解，依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g、NaOH 21g、苯酚5g、亚硫酸钠5g，逐步搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至l000ml，存于棕色瓶中，室温下放置两周后使用。

（2）0.5%魔芋胶溶液配制称取0.5g魔芋粉，加入100ml乙酸-乙酸钠缓冲液，可置于摇床中200rpm，3~4h。

常温下三天内可用。

（3）pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液制备称取三水乙酸钠11.57g，加入0.85ml冰乙酸，再加蒸馏水定容至1000ml，测定pH值。

如果偏离5.5，则用0.1mol/L的乙酸或乙酸钠溶液调至5.5。

置于4℃冰箱中备用。

1.2 实验方法1.2.1 培养基及条件(1) 斜面活化培养基及条件葡萄糖1.0%，氯化钠0.05%，麸皮1.0%，牛肉膏0.1%，磷酸二氢钾0.3%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂粉1.8%，pH=7.5，35℃恒温培养5d。

(2) 液体种子培养基及条件魔芋粉0.5%，酵母膏1.0%，硫酸镁0.1%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸铵1.0%，pH=7.5，35℃，200rpm，摇床24h。

(3) 基础产酶培养基魔芋粉0.5%，蛋白胨1.0%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸铵1.0%，pH=7.0，35℃，200rpm，摇床28h1.2.2 粗酶液的制备将摇瓶后的菌液部分倒入离心管中，在3000rpm下离心15min，所得到的上清液即为粗酶液。