产淀粉酶枯草芽孢杆菌

“生物制药技术实训”课程研究报告

项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌

一实验原理

枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。

二材料

灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。

三操作步骤

1.包平板

2.配生理盐水

3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基

4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min

5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h

6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌

7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min

8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。

9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h

10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。

11. 在无菌操作下，用接种环挑取有透明圈较为明显的菌落，于载玻片上，加入生理盐水，在高倍镜下进行观察，在观察前对菌种用番红进行染色，是观察较为容易。发现这次镜检的产淀粉酶枯草芽孢杆菌较为清晰显杆状，这次我们认定这应该是我们所需菌种。

12.对所认定的这几个培养基中的菌种进行菌种纯化，再配培养基，将菌种接种到培养基上，培养20h。

四实验结果

培养后发现无杂菌，挑取菌落镜检，发现为杆状细菌

参考文献：

[1] 张建云. α-淀粉酶原因的体外定向进化研究[D]河南农业大学, 2004

[2] 李金霞. 耐高温α-淀粉酶基因的克隆、表达及突变[D]天津科技大学, 2004 .

[3] 张强. 耐高温α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶学性质研究[D]四川大学, 2005 .

[4] 朱何东. 高温α-淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究[D]四川大学, 2006 .

[5] 杜承. 产耐高温α-淀粉酶基因工程菌的构建及酶学性质研究[D]吉林大学, 2007 .

[6] 赵子如. 古菌Sulfolobus sofaltaricus P2嗜热嗜酸淀粉酶基因的克隆和表达

[D]南京农业大学, 2006 .

生物制药0801

张静