桉树组织培养快繁技术

桉树组织培养快繁技术
林萦燕
农业技术工程系02级应用生物技术
摘要:介绍了桉树的地理分布、植物学特性、生长环境和经济价值。

论述了桉树组培的意义和国内外的研究发展史；目前已有了比较成熟的培养技术，并已在大量的生产应用。

在组培的技术方面，通过对桉树组培苗进行研究几生产实践过程,总结出了桉树从瓶苗培育成商品苗的技术过程。

比较详细的论述了桉树从初代培养的取样、材料的灭菌、接种、培养和培养基的配方；继代中的接种方法、培养基和培养条件；生根培养中的培养基的配方、接种方法和培养和条件；育苗中的炼苗、基质的准备、移栽和育苗过程中各种管理措施等。

关键词: 桉树组织培养无菌苗继代生根移栽管理
1.前言
1.1分类及地理分布
桉树是桃金娘科桉属植物的总称,自然分别于澳大利亚及华莱士线以东的澳洲大陆附近的太平洋岛屿。

从十八世纪以来,不少国家和地区就开始引种驯化,我国华南、西南和华东南地区也广泛引种栽培。

近年来,各地都在大力发展,先已在广东、广西、海南、四川、云南等省形成一定规模,产生了的生态和经济效益。

桉树种类繁多,据近代桉树分类学家Blakeln的分类,有602种,其中重要经济用材树种约100种,被广泛栽培的有40余种,主要有蓝桉、赤桉、巨桉、细叶桉、斑皮桉、柠檬桉、多枝桉等。

1.2 经济价值及生产中的问题
桉树是当今世界三大速生树种之一,已成为我国大面积造林和“四旁”植树的主要树种。

它的显著特点是:①材质坚硬,材、皮、叶、花的经济价值都很高,既是用材林、经济林、防护林、风景林，又是很好的能能源树种；②繁殖容易，速生丰产，特别是幼林期生长快，大大缩短了生长周期，大而获得较高的经济效益；③种类多，抗逆性强，既有耐热品种，也有耐寒品种，病虫害少，较耐用品瘦瘠，要在不同气候带栽种，深受群众喜爱。

桉树的木材是造纸、坑木、造船等良材，叶子可提油料，树皮可提树脂，残渣培养食用菌后还可当肥料，花是良好蜜源。

桉树是异花授粉植物，有性繁殖很容易引起变异，很难保持物种的优良性状，无性
繁殖如扦插等繁殖得很慢，无法满足生产的需要。

而桉树组培快繁可使桉树保持其遗传稳定性，其繁殖系数大，一年内一个桉树带节茎段，可以繁育百万株以上的苗木。

1.3 简史及研究进展
桉树组培始于60年代中期。

1965年，Susses首次报道从赤桉实生苗外植体获得愈伤组织。

Anneja等（1969）由柠檬桉木质块茎的愈伤组织诱导出小植株。

Cresswell等（1974）用巨桉(E.grandis)幼苗的切节进行培养，并主要报道了切节培养根发育的解剖研究；次年，Cresswell等人继续用14节以上的巨桉分枝培养，将外植体浸泡2h以除去抑制剂，结果有30%的切节腋萌发并启动根的发育。

De.Fossard等（1976）将该方法扩大应用到美丽花桉（E.ficifolia）成年树，其中有些切节的培养体产生了丛芽，但在成年组织上未能生根。

Ecluado等（1975）从白桉(E.alba)的下胚轴组织培养获得愈伤组织，并形成小植株。

Gupta等于1980年研究了柠檬桉的组培快繁技术，并于1981年用成年柠檬桉嫩枝切段培养成功获得完整植株，由成年树的一个芽在一年内可获得10万株树苗。

1981年，S.Kondas报道由一棵20年生的杂种桉树成功地培养出芽。

我国的桉树组培工作起步较晚，但进展较快。

自1978年起，广西.广东.上海等地才开始建立实验室并进行试验研究。

庄长茂（1980）对上海植物引种栽培的12种桉树进行了离体培养试验，其中葡萄桉.灰桉（E.cinerea）.王桉（E.reghans）和柠檬桉均获得大量苗木（据欧阳权、.彭海忠，1986）。

1981年，谢绮文等人对雷林一号桉优良树种进行离体培养获得了完整植株并移栽到苗圃。

广西钦州地区林科所（1979）由雷林一号桉、柠檬桉、窿缘桉嫩茎和萌条顶诱导出丛生型绿芽，经转移后获得完整植株并移栽成活，并在此研究基础上用雷林一号桉优树种子及无菌苗诱导，分化出根苗齐全的胚状体苗，随后又从柳窿（柳桉ⅹ窿缘桉）和巨窿（巨桉X窿缘桉）F1杂交种子诱导出丛生绿苗。

广西林科所1981年也成功地实现了柳窿F1的组培快繁，并移栽成活和上山造林。

1992年，邱运亮和阚文靖等成功地由赤桉的腋芽、茎尖、茎段、下胚轴等外植体再生出完整植株并移栽成活。

刘国民等1996年比较系统地研究了不同基本培养基、不同激素条件对赤桉愈伤组织形成的影响以及外植体种类和激素条件对丛生芽分化的影响，获得了完整植株，移栽成活并定植于大田。

2.桉树组织培养技术
桉树组织培养成苗途径有：由愈伤组织分化成苗，从顶芽和腋芽发育成苗，用胚性细胞诱导成苗。

本文介绍的是从顶芽和腋芽发育成苗的技术过程。

2.1 概述
桉树顶芽和腋芽在离体培养中均可被诱导发育成苗，单芽可萌生出单一的或多个苗。

将新形成的芽切割下来，使之再萌生出新的苗或丛生芽，将2-3cm的芽或茎段（带1~2个节）切割后转移到生根培养基上，就能得到能种植到土壤中去的完整小植株。

将丛生芽转移继代，约经30天可重复这种芽—苗的再生过程。

经不断重复芽—苗增殖的培养，在短时间内就能迅速获得无数的嫩茎，从而生产出大量的再生植株来。

2.2 无菌苗的获得
用纱布将桉树种子包裹浸于冷开水中10min，然后用75%酒精消毒30S，转入0.1%升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗4~5次，然后用无菌滤纸吸干水，接种于7~8g/L琼脂的无激素的MS培养基上，7~9d可生出2~3cm高的无菌苗。

以幼嫩枝节段和顶芽作外植体，可取当年萌发的幼嫩枝条上部，去叶后用洗衣粉水洗净，在超净工作台上经常规消毒后，切取顶芽或茎段（约0.8cm，带一个茎节）接种于MS+BA0.5+IBA0.2的初代培养基上。

培养条件以25±2℃，1000~1500LX，每天光照10~14h为宜。

经过30d的培养，每个外植体可形成一个或多个无菌芽。

首次接种，因材料是从田间采集而来，灭菌措施不可能很彻底，以致污染率较高，为了降低污染率，提高效率，初次接种时以每瓶放一块材料为好。

2.3 继代增殖
从上述无菌芽中选取生长较健壮的芽从原茎段上切下（约1cm，带1~2个茎节），或将密集的小丛生芽分割为单株或丛芽小束，转接到MS+BA1.0-1.5+KT0.5+IBA0.1-0.5的增殖培养基上，以促进培养物的腋芽和侧芽萌发。

通常最初转入增殖时，嫩茎增加的倍数较底，继代多次以后，增殖倍率会逐渐增加，继代增殖在23℃~25℃条件下，约30~35d 转接一次，继代次数不能超过8，否则很容易引起物种变异。

芽的增殖速度在离体快速繁殖中是最为重要的一环，在这阶段中繁殖速度快生产实践中才有应用价值。

决定繁殖速度的因子最主要是材料本身的生理生长状态和培养基及其附加成分的相互作用。

通过适当的处理可以改善—外植体的生理状态。

如对赤桉，在外植体的继代培养中发现，如果总在23℃~25℃条件下培养，芽就会逐渐死亡，但如每次继代培养繁殖时，先在15℃下培养3d，再转到25℃下培养，外植体便可保持其良好的繁殖速度。

在培养过程中发现，芽的增殖在25℃恒温下培养，且无昼夜温差，芽就会逐渐发黄枯竭，但在继代培养中期，置于10℃~15℃下培养3~5d，再转入25℃恒温
下培养，芽生长速度加快，有效芽增多。

不超一个月便继代培养一次，可大大提高繁殖效率。

2.4 生根培养
将继代增殖培养过程中获得的丛芽（无根苗）分割成单株，或将其中较大的个体切割成长约1cm的带一个腋芽的茎段，然后转接到1/2MS+ABT一号生根粉1.5+IBA0.1+0.25%活性炭生根培养基上，经25d左右培养，即可获得可供瓶移栽的完整植株。

接入生根培养基10d左右即可生根，在上述培养基中，生根率虽然较高，但大多数根是从植株下端愈伤组织分化出来的，移栽时，根较易脱落，且易污染，成活率不高。

经过实验，其结果表明ABT与IBA配合的使用，有利于桉树生根，其生根率是单独使用IBA的2.7~8倍，每株生根数是单独使用IBA的1.7~6倍，并促进了芽的生长。

ABT浓度超过1.5，则抑制芽的生长。

IBA浓度超过0.01，就可诱导愈伤组织的产生，使根从愈伤组织中生出，从而影响移栽的成活率。

为抑制生根过程中愈伤组织的产生，促进芽的生长，又设计了1/2MS+ABT1.0-1.5+IBA0.05；1/2MS+ABT1.0-1.5+赤霉素0.05的生根培养基。

结果表明，在培养基中添加GA3可明显抑制生根中愈伤组织的产生，且促进苗的生长，生根率、每株生根数和ABT1.0-1.5与IBA0.05配合使用差不多。

2.5 瓶苗的移栽、管理
当桉树幼苗长至株高3~4cm时即可出瓶移栽。

但瓶苗要从培养基移栽到土壤中，是一个由“异养”到“自养”的转变，这种转变有个逐渐锻炼适应的过程。

在桉树的组织培养中，常常见到在培养基中生长得很好，可一旦从瓶中移出，往往会大量死亡，成活率很底。

这是由于瓶苗一直在无菌、适温、高湿、低照度的微环境下生活，而移出后条件改变剧烈，处于恶劣的环境中，一旦处理不当，就会导致失败。

因此，移栽前要在室内或室外弱光下揭开瓶盖炼苗3~5d，让幼苗逐渐适应外界环境条件。

移栽时向瓶内倒入一定量清水并摇动几下以松动培养基，然后用长镊或小钩小心将幼苗取出放置在盛有清水的盆中，小心地将根黏附的培养基彻底洗干净，以免培养基中的营养物质招致真菌或细菌大量繁殖生长，而使苗污染死亡。

选择生长健壮，根系发达，幼苗基部刚长出3~4条白色根，根系损伤极少的苗移栽到营养袋中。

营养土不能采用有机质多的肥沃土壤，以免造成霉菌危害，一般采用深层少菌的黄土。

将黄土装入营养袋后，用0.3%高锰酸钾溶液或多菌灵等灭菌药喷淋一遍
后再栽植，然后用喷雾器浇足定根水。

移栽淋透定根水后，设塑料拱棚保湿（相对湿度在85%以上，温度保持25℃~30℃）。

用70%的遮阳网搭阴棚以避免直射阳光曝晒，并防止棚内温度过高。

浇水要少浇勤浇，每天2~3次，至少早晚个一次，每次要浇透。

移栽一周后，可用MS液或0.2%的尿素液进行喷雾施肥，以促进苗木生长。

每周1~2次。

10~15d后，可揭开遮阳网使其逐渐适应日光照射。

一个月后，可将苗移到室外进行炼苗，让幼苗在自然条件下风吹日晒，这样苗生长健壮，抗逆性增强，容易成活。

此阶段要加强水肥管理和病、虫、草害防治。

经1~2个月的精心管理，当苗高15~20cm 时即可上山造林。

参考文献
[1]刘德华等.实用植物组织培养技术教程. 甘肃科学技术出版社，1994.20（3）：232
[2]刘国民等.植物组织培养手册. 上海科学技术出版社，1997.15（4）：26
[3]王怀志. 植物组织培养与繁殖上的应用. 上海科技教育出版社，1998.13（6）：22。