动物实验基因沉默过表达研究方法及具体步骤

目录

第一部分：吉玛现有可以用于动物实验的产品介绍 (3)

化学修饰的oligo （siRNA、agomir、antagomir） (3)

腺病毒 (3)

慢病毒 (5)

腺相关病毒（AA V） (7)

第二部分：动物实验的必要性 (11)

第三部分：动物实验指南 (16)

1、Oligo(siRN0A/miRNA/plasmid)注射小鼠方案 (20)

2、腺病毒注射小鼠方案 (44)

3、慢病毒注射小鼠方案 (53)

4、AA V注射小鼠方案 (67)

第四部分：常见动物实验操作简述 (81)

第一部分：吉玛现有可以用于动物实验的产品介绍

化学修饰的oligo （siRNA、agomir、antagomir）

siRNA介绍

吉玛基因化学修饰siRNA Oligo 不仅增强了siRNA 在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA 作用时间相比，吉玛基因化学修饰siRNA Oligo 的作用时间可延长一倍左右。

MicroRNA agomir 介绍

agomir 是根据microRNA 成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的双链小RNA 分子,是用于模拟内源性成熟体miRNA 序列。agomir 包括一条与目标miRNA 成熟体序列一致的序列，以及一条与miRNA 成熟体序列互补的序列。特异的MicroRNA agomir 能够被导入到表达对应microRNA 的细胞内，模拟microRNA 的作用，或者与构建有miRNA 结合位点的双荧光素酶报告系统结合，验证miRNA 与靶基因之间的调控关系。

修饰方式：agomir 仅在反义链上进行化学修饰，3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代修饰，3’端4 个硫代修饰，反义链全碱基甲基化修饰。

MicroRNA antagomir 介绍

antagomir是根据microRNA成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的单链小RNA,是专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。特异的MicroRNA antagomir 能够被导入到表达特异的microRNA 的细胞内，抑制microRNA 的作用，也可以用来抑制表达特异的内源性的miRNA 的报告载体的表达。抑制特异性的内源性的miRNA为了分析miRNA 对生物过程和内源性的靶的作用效果，miRNA antagomirs 可以被转染入细胞评价此效应能否被逆转。

修饰方式：antogimir 3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个

硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。

腺病毒

一、产品简介

腺病毒(Adenovirus，Adv)是一种线性双链DNA 病毒。腺病毒不仅可以作为哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋

白（Massie et al., 1998a,b）。迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述表明：重组腺病毒在科学研究和治疗应用领域都具有很大的潜力，同时作为基因转移工具相对于其他病毒载体有多方面的优势。

Genepharma 运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，无需进行细菌体内的同源重组步骤，无需使用多蚀斑分离方法分离目的重组腺病毒的步骤，因此较其他系统生长更快，并且大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，不产生复制型腺病毒，因此更为安全。

二、腺病毒载体优势

1)可感染的细胞种类多，宿主范围广，几乎可以感染所有类型的细胞；

2)感染效率高，重组腺病毒被广泛应用于使用脂质体转染效率较低细胞的基

因转导和蛋白表达；

3)包装外源基因的片段大，高达8kb；

4)腺病毒载体构建及包装容易操作，易于制备出滴度高的大量病毒；

5)当腺病毒感染细胞后，病毒基因组存在于细胞染色体外，不整合到细胞染色体中，避免了因整合引起的基因突变及激活致癌基因，生物安全性高。

三、生物安全性

安全性

Genepharma 运用了去除5' ITR、包装信号和E1 序列的全新的腺病毒骨架基因，大大降低了重组形成野生型可复制腺病毒的危险；无E1a，除 293 细胞等能反式提供

E1 蛋白的细胞株外，重组腺病毒在其它细胞当中都无法复制。所生产的腺病毒只能用于科学研究，不能用于诊断和治疗。

重组腺病毒的安全等级被NIH 官方定为BL-2 级，使用时请严格遵从NIH 推荐的安全指南。更多生物安全标准信息，您可以从

/获得。

实验室安全措施

1)在实验室工作时，请穿着连体衣、隔离服或工作服；应戴上合适

的手套和口罩。

2)病毒操作时请使用生物安全柜。如果使用普通的超净工作台操

作病毒，请在取用病毒前关闭风机，并在关闭所有含有病毒的相应容器

盖子后，再打开风机。

3)所有操作请尽量减少气溶胶和微小液滴的形成。如果出现病

毒污染，请立即用

70%的酒精加1%SDS 溶液擦拭干净。

4)如需离心，应使用密封性好的离心管，可用Para film 膜封口后

在专用离心机中离心。

5)用显微镜观察细胞感染情况时请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，

并在使用70%乙醇清理瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜试验

台之后，用70%乙醇清理显微镜实验台。

6)所有受到污染的材料、标本和培养物在废弃或清洁再利用之前，

必须清除污染。

废弃的含病毒的培养基加入84 消毒液（1:20 左右），浸泡一天后丢弃。接触

过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84 消毒液稀释液处理，也可

以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）。手套用完后，应先消

毒再摘除，随后必须洗手。

四、流程描述

制备腺病毒颗粒的穿梭质粒及其骨架质粒，上述质粒载体分别进行高纯

度无内毒素抽提，用本公司的转染试剂RNAi-Mate 进行共转染293A 细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养十几天，每七天左右补充一次新鲜培养基，然后收集细胞和上清液置于离心管中，冻融三次，2000rpm 离心 5 分钟，

取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，而后对其纯化和浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T 细胞中测定

并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的腺病毒颗粒可以满足大部分体内体外

实验需求。

慢病毒

一、产品简介

目前，我公司慢病毒载体是以国际通用的第三代载体系统为基础，通过一定改建，构成四质粒体系。其中，转移载体（transfer vector）包含转移目的基因的