OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤

OMEGA质粒提取试剂盒操作步骤

1．在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml LB培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37℃振荡培养12-16h。需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.

2．取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min

3．去上清，加250µl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。

4．加入250µl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖)

5．加350µl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀

6. 室温13000×g离心10min.

7．特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱

8．弃滤过液，加500µl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。

如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略

9．弃滤过液，再用100%乙醇稀释的700µl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min.注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签，如果经过冷冻，用前必须恢复室温

10．此步可选：再加700µl Wash Buffer清洗吸收柱

11.必须将吸收柱13000×g离心2min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。

12.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加30-50µl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE 缓冲液在滤膜上，13000×g离心1min，一次可洗脱75-80%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）。

13. 检测：方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度

DNA浓度＝260nm吸光度×50×稀释因子μg/ml

高质粒拷贝数能达到5ml培养液得到25μg DNA，如果260nm吸光度/280nm吸光度大于1.8，说明核酸大于90%。

方法B：和预知浓度DNA样品（Marker）一起做琼脂糖凝胶/嗅乙啶电泳，对比结果（通常情况得到的DNA是单体超螺旋，也有少量多联体）