荧光标记

γ计数器
放射免疫测定技术的操作注意要点
反应的温度与时间
结合相与游离相的分离
免疫标记技术的比较
FIA 敏感性 较低 ELISA 高 RIA 高
特异性
重复性 检测对象
高
差 Ag/Ab
高
好 Ag/Ab
高
好 Ag
本章小结
1、标记免疫技术的类型 2、ELISA技术的原理与方法 3、荧光抗体技术的原理与方法 4、RIA技术的原理与方法
思考题
1、如何区别均相型与非均相型的测定方式？
2、ELISA分几种类型，各有哪些特点？
3、适于标记的荧光素应符合哪些要求？
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
NaIO4
O O O O O O
酶-五炭糖环
+ NH2抗体
NaBH4
O
O
O OH N 抗体
O N 抗体
本章小结
1、免疫标记技术的概念
2、常用免疫标记物质及其标记方法
3、标记免疫物质的分离与鉴定
思考题
1、何谓免疫标记技术？ 2、常用的免疫标记物质有哪些？
3、酶标记的主要方法有哪些？
4、F/P比值的实用意义如何？ 5、何谓比放射性？有何意义？
第一节
标记免疫技术的分类
一、按指示标记物质划分的类型
二、按测定方式划分的类型
第一节
免疫标记技术的基本概念
一、免疫标记与标记免疫的概念
二、常用的免疫标Βιβλιοθήκη Baidu物质
免疫标记与标记免疫
免疫标记技术： 标记物与免疫活性物质的联接技术
标记免疫技术： 以标记免疫物质检测相应靶物质的技术
常用的免疫标记物质
类别 荧光素 标记物 FITC、RB200、TRITC 镧系元素螯合物 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr
酶扩大免疫测定技术
按测定用途划分的类型
1、免疫测定技术
2、免疫组化技术
第二节
酶联免疫吸附试验
一、ELISA技术的原理与方法
二、 ELISA技术的操作注意要点
ELISA技术的原理与方法
间接法
夹心法
竞争法
间接法
夹心法
竞争法
酶标仪
酶标仪
ELISA技术的操作注意要点
试剂器材
操作环节
合适工作浓度
荧光素-SO2 Cl + PCl3 + NaCl
荧光素-SO2 Cl + NH2-抗体
荧光素-SO2 -NH-抗体 + HCl
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离荧光素
方法：柱层析
2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义
第四节
放射性核素标记技术
一、常用标记方法
二、标记免疫物的分离与纯化
吸收滤片
激发滤片
荧光滤镜使用原理
第四节
放射免疫测定技术
一、放射免疫测定技术的原理与方法
二、放射免疫测定技术的操作注意要点
结合相
游离相
放射免疫分析法的原理与方法
结 40 合、 游 离 30 相 放 射 20 性 含 量 10 比 值 1 2 5 10 20 50 100
未标记抗原含量
β液闪仪
第三节
荧光抗体技术
一、荧光抗体技术的原理与方法
二、荧光抗体技术的操作注意要点
荧光抗体技术的原理与方法
直接法
间接法
补体法
双标记法
直接法
间接法
补体法
双标记法
荧光抗体技术的操作注意要点
标本处理
染色操作
结果观测
荧光显微镜
荧光显微镜使用原理
激发滤片（BG）
标本
吸收滤片（OG）
FITC吸收光峰值：490-495nm FITC发射光峰值：520-530nm BG：325-500 OG：410-650
常用标记方法
1、常用放射性核素
2、125I 的标记方法
直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）
直接法（氯胺T法）
-NHCHONHCH2 -NHCHONH-
氯胺T
Na125I 4。C
125I
CH2
OH
OH
间接法（连接法）
OH NSHPP OH 氯胺T
125I
+ Na125I
CH2 O CH2 O
H-C-C-O-N-C-CH2 H O O=C-C-CH2
生物标记荧光素的要求
1、具有与蛋白质共价结合的能力
2、荧光效率高
3、能与背景物质形成鲜明对比
4、不影响蛋白质的生物、免疫活性
5、标记方法安全、简便
6、标记物稳定，易保存
FITC的标记原理与方法
荧光素-N=C=S + NH2-抗体
荧光素-N-C-N-抗体
H S H
RB200的标记原理与方法
荧光素-SO3Na + PCl5
H2O
O
N OH
O OH 抗体
O
Schiff碱
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析 2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
第三节
荧光标记技术
一、常用标记方法
二、标记免疫物的分离与纯化
常用标记方法
1、荧光素的概念
2、生物标记荧光素的要求
3、常用荧光素标记原理与方法
碱性磷酸酶（AP） 2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体
酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
125I、131I
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
酶
HRP、AP
免疫组化
免疫分析测定
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫分析测定 免疫组化 免疫分析测定
第二节
酶标记技术
一、常用标记方法
二、标记免疫物的分离与鉴定
常用标记方法
1、常用酶
辣根过氧化物酶（HRP）
三、按测定用途划分的类型
按指示标记物质划分的类型
1、酶免疫技术
2、荧光免疫技术
3、放射免疫技术
4、发光免疫技术
5、金免疫技术
按测定方式划分的类型
1、均相型（homogenous）
2、非均相型（heterogeneous）
均相型（homogenous）
非均相型（heterogeneous）
双标记均相荧光免疫测定
H-C-C-O-N-C-CH2 H O O=C-C-CH2
间接法（连接法）
OH
125I
OH
125I
+ NH2-蛋白质
CH2 O CH2 H-C-C-N-蛋白质 HO H H-C-C-O-N-C-CH2 H O O=C-C-CH2
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析 2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义