第七章 色谱分离技术

产
鞣质类、抗生素
物
生物大分子：蛋白质、酶、多肽、核酸、多糖
色谱分离方法的选择依据：
① 目的产物的分子结构、物理化学性质及相对 分子质量；
② 主要杂质，特别是分子结构、大小和理化特 性与目的产物相近的杂质成分与含量；
③ 目的产物在色谱分离过程中的生理活性的稳 定性。
四、离子交换色谱法
与离子交换法的区别？
人工合成，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。 对芳香族、杂环化合物有不同程度的吸附作用。
凝胶的预处理
（三）操作方法
层析柱的选择 凝胶柱的装填
样品处理和加样
洗脱与收集 凝胶的保存
1、凝胶的预处理：充分溶胀
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1.来自百度文库葡聚糖凝胶
流动相流经固定相时，由于物质在两相间的 分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离； 或者说，易分配于固定相中的物质移动速度慢， 易分配于流动相中的物质移动速度快，因而逐 步分离。
（2）基本特点：
① 分离效率高。其效率是所有分离纯化技术中最高
的，这种高效的分离尤其适于极复杂混合物。
② 应用范围广。（非）极性、（非）离子型、小分
利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测 定溶液中阳离子和阴离子的一种分离方法。
基本原理：
带电物质因电荷力作用而在固定相和流动相之 间分配得以相互分离。
两性电解质（蛋白质、氨基酸）在不同溶液中 所带的净电荷的种类和数量不同：
pH = pI; pH < pI； pH > pI ?
溶液pH偏离pI越远，则净电荷量越大。
由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同， 可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与 离子交换树脂的吸附作用，从而将它们分离。
离子交换树脂（固定相）的性质、种类、选择 依据、离子交换色谱的操作及应用
五、凝胶色谱法
凝胶色谱法：以凝胶为固定相、基于分子大 小不同而进行分离的一种方法。因其整个过程 和过滤相似，又称凝胶过滤、分子筛过滤等。
菊根粉或 碳酸钙
薄层色谱
连续色带—色层或色谱 色谱法得名
气相色谱
高效液相色谱 离子色谱、凝胶色谱、亲和色谱
2.色谱法的特点
（1）概念 色谱法是一种物理的分离方法，利用不同物
质在两相中具有不同的分配系数，并通过两相 不断的相对运动而实现分离的方法。
其中一相是固定相，通常是表面积很大的或 多孔性固体；另一相是流动相，是液体或气体。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
操作方法
柱色谱法 纸色谱法
薄层色谱法 气相色谱法
流动相的物态
液相色谱法
实验技术
迎头法 顶替法 洗脱分析法
4.色谱分离方法的选择
初级代谢产物：氨基酸、有机酸、核苷酸、
目
单糖类、脂肪酸
的 次级代谢产物：生物碱、萜类、糖苷、色素、
子和大分子、无机和有机及生物活性物质、热（不）稳 定化合物；尤其是对生物大分子的分离，其他方法无法 取代。
③ 选择性强。可变参数很多：不同的色谱分离方法、
固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
孔隙度通过改变琼脂糖浓度而达到（与葡聚糖不同） （联系琼脂糖凝胶电泳）
化学稳定性：琼脂糖凝胶 < 葡聚糖凝胶 没有干胶，必须在溶胀状态保存。
能分离几万至几千万高相对分子质量的物质， 分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随 浓度上升而提高。
适用于核酸、多糖和蛋白质类物质的分离。
3. 聚丙烯酰胺凝胶
近40年来，色谱技术已成为生物大分子分离 和纯化技术中极重要的组成部分。
胰岛素、干扰素、疫苗、抗凝血因子、生长 激素等。
概述 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 高效液相色谱法 亲和色谱法
一、概述
1.发展史
创始人：茨维特（Tsweet）1906 纸色谱
石油醚
植物色 素的石 油醚提 取液
离子交换法：应用离子交换剂作为吸附剂，通过静 电引力将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂 上，然后用合适的洗脱剂将吸附物从离子交换剂上洗 脱下来，从而达到分离、浓缩、纯化的目的。
离子交换树脂 组成 活性离子
离子交换色谱法的固定相应该是什么？
离子交换色谱法：利用离子交换树脂作为固定 相，以适宜的溶剂作为流动相，使溶质按它们的 离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。
应用最广泛的一类凝胶。 由葡聚糖Dextran交联而得。
在制备凝胶时添加不同比例的交联剂可得到交联度 不同的凝胶。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫 做交联度。
交联度大：网状结构紧密，吸水量小 交联度小：网状结构疏松，吸水量多
化学性质比较稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液
2. 琼脂糖凝胶
来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶， 不是共价交联，而是以氢键交联，键能较弱。
第七章 色谱分离技术
产生的必然性
随着科学的进步，某些关系到人们生命安全 的生物药品，尤其是注射药品和生物工程产品 等，都需要高度纯化。但是，经典的分离方法 （如萃取、结晶等）很难满足需要。
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
是产品的最后纯化工序（精制），即在用色 谱纯化之前需要经过其他方法进行提取和初步 纯化。
凝胶：一种不带电荷的具有三维空间的多孔 网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构 就如一个筛子。
（一）原理
利用有一定孔径的多孔的亲水性凝胶作为载体， 当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径 大于凝胶孔径的大分子由于不能进入胶粒内部，便 随着溶剂在胶粒间隙向下移动并最先流出柱外；直 径小于凝胶孔径的分子能不同程度的自由出入凝胶 珠的内外。这样不同大小的分子由于所经的路径不 同从而得到分离，大分子物质先被洗脱下来，小分 子物质后被洗脱下来。