细胞生物学常用技术1只是分享
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(1)原理
波长 振幅 速度
颜色 亮度 相位
(2)应用
活体细胞观察
5.激光扫描共焦显微镜
（ Laser Scanning Confocal Microscope）
(1)原理
在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置， 共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。
➢单色激光光源 ➢光源后－照明针孔－点光源
检测器前－探测针孔 ➢分层扫描 三维重建
细胞生物学常用实验技术
cellular level Subcellular level Molecular level
显微技术 细胞分离技术 细胞培养技术 细胞组分的分级分离 细胞示踪技术 细胞分子生物学技术
一、显微镜技术 microscopy
μm 微米 = 10-6 m nm 纳米 = 10-9 m Å 埃 = 10-10 m
胰酶
细胞间连接 细胞外基质
单一细胞
2.分离不同类型细胞 (1) 离心 （centrifugation）
源自文库
大小 密度 形状
小
轻
不规则
大
重
圆形
(2) 免疫磁珠法
利用带有特定单抗的免疫磁珠 与靶细胞的特异结合，快速地 从多细胞悬液中将目的细胞分 离出来。
Fe2O3或Fe3O4颗粒 +
单克隆抗体
免疫磁珠
(3) 流式细胞仪 ( flow cytometry)
二、细胞分离技术 （ cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
1.制备单一细胞悬液
组织 消化
EDTA
胰酶
细胞间连接 细胞外基质
单一细胞
二、细胞分离技术 （ cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
1.制备单一细胞悬液
组织 消化
EDTA
固定的目的： A 防止组织自溶或腐败 B 保持细胞原有的形态 C 保持细胞各种成分的原有位置
常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛
(2)脱水
定义：借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程 常用的脱水剂：酒精
(3)包埋
定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。 常用的包埋剂：液体石蜡、树脂
(4)切片
1-10 μm
共扼
（2）应用
A 细胞的三维重建 B 细胞定量荧光检测
DNA RNA 蛋白质含量 C 细胞内Ca2+ pH动态检测 D 细胞间通讯
果蝇胚胎原肠胚
（二）电子显微镜技术
利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术
亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点
高分辨率
理论上 d = 0.002 nm 实际上 d = 0.1 nm 生物标本 d = 2 nm
高放大倍率 1,000,000
2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造
阴极
阳极 聚光镜（电磁透镜）
物镜 中间镜 投影镜
照相底片
电镜照片
真空、上下颠倒
(2) 超薄切片的制备
A 固定 戊二醛:蛋白质
锇酸: C=C (膜结构)
B 脱水
(1)原理 二次电子
(2)分辨率 3-10nm
(3)样品的制备
A 固定 B 脱水 C 干燥 临界点干燥 D 染色 Au Pt
透射电镜 利用穿透标本的电子进行成像 (散射) 观察组织的二维切片 扫描电镜 利用标本表面发射的二次电子成像 观察组织的表面三维结构
（三）扫描探针显微镜
（Scanning probe microscope, SPM）
*
*
*
*
*
*
3.荧光显微镜技术
(1) 原理
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光
紫外光 short
可见光 λ
红外光 long
（2）荧光显微镜的基本构造
A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 滤光片
（3）常用的荧光染料
A 有机染料
上升梯度
乙醇：30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%
C 包埋 单体树脂加温聚合
D 切片 500 –700 Å
E 重金属染色 U(醋酸双氧铀) Pb(柠檬酸铅)
NADP酶反应
嗜锇反应 TPP酶反应
2.扫描电子显微镜
（Scanning electron microscopy, SEM）
能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或 化学特性的技术 A 原理: 抗原+抗体*
荧光标记
B 样品制备
细胞悬液制备 细胞固定 细胞染色
B 应用
* 细胞分选 cell in 1000 5000 cells/sec
* 细胞大小测量 * DNA 含量测定 * 免疫表型分析 * 细胞功能分析 * 细胞凋亡研究
(一) 光学显微镜技术
利用光线照明,将微小 物体形成放大影像的 仪器
1.显微镜的分辨率 显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力。
d=
0.61 λ n sinθ
光学显微镜的分辨极限0.2μm
100μm 0.2μm
2.光镜标本切片的制备
(1) 固定
定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细 胞中大分子间形成交联，保持细胞 中原有结构的形态和位置的过程。
1.扫描隧道显微镜 使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探
针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表 面形貌变化的隧道电流。
➢ 分辨率高 ➢ 可在非真空状态下工作 ➢ 直接观察大分子的三维结构
2.原子力显微镜 通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用
力来获取所观察表面的微观信息。 ➢ 样品无需具有导电性 ➢ 可在三态下工作 ➢ 活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结 晶体表面观测
荧光素 罗丹明 FITC
B 量子点 quantum dot
Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素构成的半导体纳米结晶
良好的光学稳定性 抗光漂白性
（4）应用
A 免疫荧光显微技术
（Immunofluorescence microscopy）
抗体 + 荧光染料
B 绿色荧光蛋白 GFP
4.相差显微镜 （phase contrast microscope）
（5）染色
采用某些化学物质特异性或选择性地与细 胞内的某些成分相互作用，从而原位显示 细胞某种成分或结构的方法
A 选择性染色
考马斯亮蓝 – 蛋白质 Brachet反应
hematoxylin-eosin
B 特异性染色
酶 + 底物
+ substrate
抗原 + 抗体
antigen
* *
*
* **
antibody 酶标记：免疫组织化学技术 荧光标记：免疫荧光技术
波长 振幅 速度
颜色 亮度 相位
(2)应用
活体细胞观察
5.激光扫描共焦显微镜
（ Laser Scanning Confocal Microscope）
(1)原理
在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置， 共轭聚焦装置和检测系统而形成的显微镜。
➢单色激光光源 ➢光源后－照明针孔－点光源
检测器前－探测针孔 ➢分层扫描 三维重建
细胞生物学常用实验技术
cellular level Subcellular level Molecular level
显微技术 细胞分离技术 细胞培养技术 细胞组分的分级分离 细胞示踪技术 细胞分子生物学技术
一、显微镜技术 microscopy
μm 微米 = 10-6 m nm 纳米 = 10-9 m Å 埃 = 10-10 m
胰酶
细胞间连接 细胞外基质
单一细胞
2.分离不同类型细胞 (1) 离心 （centrifugation）
源自文库
大小 密度 形状
小
轻
不规则
大
重
圆形
(2) 免疫磁珠法
利用带有特定单抗的免疫磁珠 与靶细胞的特异结合，快速地 从多细胞悬液中将目的细胞分 离出来。
Fe2O3或Fe3O4颗粒 +
单克隆抗体
免疫磁珠
(3) 流式细胞仪 ( flow cytometry)
二、细胞分离技术 （ cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
1.制备单一细胞悬液
组织 消化
EDTA
胰酶
细胞间连接 细胞外基质
单一细胞
二、细胞分离技术 （ cell separation）
从活体组织获得相对单一类型的细胞群的方法
1.制备单一细胞悬液
组织 消化
EDTA
固定的目的： A 防止组织自溶或腐败 B 保持细胞原有的形态 C 保持细胞各种成分的原有位置
常用固定剂：乙醇、甲醛、戊二醛
(2)脱水
定义：借助某些化学溶剂置换组织内水分的过程 常用的脱水剂：酒精
(3)包埋
定义：将组织块包入包埋剂使组织硬化的过程。 常用的包埋剂：液体石蜡、树脂
(4)切片
1-10 μm
共扼
（2）应用
A 细胞的三维重建 B 细胞定量荧光检测
DNA RNA 蛋白质含量 C 细胞内Ca2+ pH动态检测 D 细胞间通讯
果蝇胚胎原肠胚
（二）电子显微镜技术
利用电子与固体样品作用时所发出的信息, 对样品进行微区观察和分析的技术
亚显微结构 超微结构 1.电子显微镜的特点
高分辨率
理论上 d = 0.002 nm 实际上 d = 0.1 nm 生物标本 d = 2 nm
高放大倍率 1,000,000
2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM） (1)基本构造
阴极
阳极 聚光镜（电磁透镜）
物镜 中间镜 投影镜
照相底片
电镜照片
真空、上下颠倒
(2) 超薄切片的制备
A 固定 戊二醛:蛋白质
锇酸: C=C (膜结构)
B 脱水
(1)原理 二次电子
(2)分辨率 3-10nm
(3)样品的制备
A 固定 B 脱水 C 干燥 临界点干燥 D 染色 Au Pt
透射电镜 利用穿透标本的电子进行成像 (散射) 观察组织的二维切片 扫描电镜 利用标本表面发射的二次电子成像 观察组织的表面三维结构
（三）扫描探针显微镜
（Scanning probe microscope, SPM）
*
*
*
*
*
*
3.荧光显微镜技术
(1) 原理
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波 长的短波光线，并发射出比原来吸收波长 更长的光
紫外光 short
可见光 λ
红外光 long
（2）荧光显微镜的基本构造
A 紫外光光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 滤光片
（3）常用的荧光染料
A 有机染料
上升梯度
乙醇：30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%
C 包埋 单体树脂加温聚合
D 切片 500 –700 Å
E 重金属染色 U(醋酸双氧铀) Pb(柠檬酸铅)
NADP酶反应
嗜锇反应 TPP酶反应
2.扫描电子显微镜
（Scanning electron microscopy, SEM）
能够快速分选或检测细胞及其组分的物理或 化学特性的技术 A 原理: 抗原+抗体*
荧光标记
B 样品制备
细胞悬液制备 细胞固定 细胞染色
B 应用
* 细胞分选 cell in 1000 5000 cells/sec
* 细胞大小测量 * DNA 含量测定 * 免疫表型分析 * 细胞功能分析 * 细胞凋亡研究
(一) 光学显微镜技术
利用光线照明,将微小 物体形成放大影像的 仪器
1.显微镜的分辨率 显微镜或人眼在25cm的明视距离处,能分辨 被检物体微细结构最小间隔的能力。
d=
0.61 λ n sinθ
光学显微镜的分辨极限0.2μm
100μm 0.2μm
2.光镜标本切片的制备
(1) 固定
定义：将组织浸入化学试剂中，通过在细 胞中大分子间形成交联，保持细胞 中原有结构的形态和位置的过程。
1.扫描隧道显微镜 使用原子尺度的探针在标本表面扫描，在探
针针尖和样品之间施加一定电压，产生随标本表 面形貌变化的隧道电流。
➢ 分辨率高 ➢ 可在非真空状态下工作 ➢ 直接观察大分子的三维结构
2.原子力显微镜 通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用
力来获取所观察表面的微观信息。 ➢ 样品无需具有导电性 ➢ 可在三态下工作 ➢ 活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结 晶体表面观测
荧光素 罗丹明 FITC
B 量子点 quantum dot
Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素构成的半导体纳米结晶
良好的光学稳定性 抗光漂白性
（4）应用
A 免疫荧光显微技术
（Immunofluorescence microscopy）
抗体 + 荧光染料
B 绿色荧光蛋白 GFP
4.相差显微镜 （phase contrast microscope）
（5）染色
采用某些化学物质特异性或选择性地与细 胞内的某些成分相互作用，从而原位显示 细胞某种成分或结构的方法
A 选择性染色
考马斯亮蓝 – 蛋白质 Brachet反应
hematoxylin-eosin
B 特异性染色
酶 + 底物
+ substrate
抗原 + 抗体
antigen
* *
*
* **
antibody 酶标记：免疫组织化学技术 荧光标记：免疫荧光技术