离子交换层析注意事项

离子交换层析操作时的注意事项

离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。

(1)层析柱

离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。

(2)平衡缓冲液

离子交换层析的基本反应过程就是离子交换填料平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH 的选择对于分离效果有很大的影响。平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH 的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换填料有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换填料的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换填料有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换填料结合或结合不稳定。在一些情况下(如污水处理)可以使杂质与离子交换填料有牢固的结合，而样品与离子交换填料结合不稳定，也可以达到分离的目的。

另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换填料结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。

(3)上样

离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH 值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。

(4)洗脱缓冲液

在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH 两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换填料结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH 的洗脱，对于阳离子交换填料一般是pH 从低到高洗脱，阴离子交换填料一般是pH 从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了，可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。

洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换填料上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。(5)洗脱速度

洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。

(6)样品的浓缩、脱盐

离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。

所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。