第二十二章---基本分子生物学技术
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机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析 。 •由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀 刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为 DNA芯片技术
目录
基因芯片技术原理
• 大规模集成的固相杂交
• 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变 性和复性的原理
二、DNA链末端合成终止法
目录
DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析 自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸， 然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳 或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA 片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测 器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
Cycle 1
5 5 5
5
Cycle 2
5 5 5 5
目录
5
5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
目录
PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n
以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片
段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互 补，然后通过定性、定量分析得出待测样品 的基因序列及表达的信息。
基因芯片技术的应用领域
临床疾病的 基因诊断
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
•引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为 过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 •引物GC含量在45%~55%间，Tm值最好近72℃.GC含量（composition）过 高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 •上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度， 即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度， 一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最 佳。
够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中
存在的特定基因，核酸探针既可以是人工合成的寡核苷酸片 段，也可以是基因组DNA片度、CDNA片段全长或部分片段，
还可以是RNA片段。
将一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或 全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结 合，判断是否有同源的核酸分子存在。
• （二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
• 也叫做Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种 将RNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维素膜上的方法
• 用于RNA的定性定量分析。
• （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
• 也叫做Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异的蛋白 质， • 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与 膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子 即可。
（4）检测
检测的方法依标记探针的方法而异 放射性同位素标记的探针：需要用放射自显影来检测 其在膜上的位置； 生物素等非同位素方法标记的探针：需要用相应的免 疫组织化学的方法进行检测。
印迹技术的应用
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠 成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结 构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物 自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的 互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理
基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发
生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂
点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而 获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影 即可在X胶片上读出DNA链的序列。
（2）制备探针
基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA
互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因， 也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身， 也可以是由之转录而来的RNA或合成的寡核苷 酸。
（3） 杂交
预杂交：用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结 合位点。 杂交：由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一
溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链
分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
印迹技术的基本过程
（1）制备样品
从待检测组织样品提取DNA或RNA DNA或RNA经酶切消化 酶切片段的电泳分离 凝胶变性处理后转膜
• （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) • 也叫做Southern 杂交，即DNA-DNA杂交分 析。是研究DNA图谱的基本技术。
•
• •
主要用于基因组DNA、如在基因组中特定基
重组质粒和噬菌体的分析。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析中
因的定位及检测等。
具有重要的价值。
引物设计原则
• 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一 端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一 条DNA模板链互补。 • PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有 效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成 功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成
连续4个碱基的互补。
• 11. 引物应具有特异性。 • 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如 果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的 实验了。 • 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。 有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏 低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作 克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计 的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次， 尽量去满足条件。
三、PCR的基本反应步骤 变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
优
• 特异性强 • 灵敏度高
点
---- 模板量要求 ng 级水平
• 操作简便快捷；
• 对待检原始材料质量要求较低
PCR的主要用途
目的基因的分离和克隆 基因的体外突变 DNA的微量分析
---- 病原微生物的检测 ------遗传病的检测 法医学（犯罪个体的认定；亲子鉴定
(n 为循环次数)
34× 109
PCR技术的基本原理
• ---- 体外模拟DNA的体内复制
• ---- 严格遵循碱基互补配对原则
DNA体内复制与ຫໍສະໝຸດ BaiduCR的对比
模板 体内复制 DNA DNA
聚合酶
引物
解旋解链 解旋酶
DNA Pol Ⅲ 引物酶 Taq 人工合成DNA
解链酶
PCR 热变性
PCR体系基本组成成分
核
酸
分
子
杂 交
（二）印迹技术
• • 首先由E.Southern于1975年提出的 将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放
在固定化介质上并加以检测分析的技术。
• 由于这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，所 以称之为“blotting”,即 “印迹”。
（三）探针技术
探针 (probe) 指带有特殊标记的核酸片段，它具有特定的序列，能
应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引 物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体 外复制DNA的过程。是基于天然DNA复制的原理而设计 的一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应，又称
基因扩增技术。
一、基本工作原理
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过 PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开， 放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的 DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
第二十一章
常用分子生物学技术的原理 及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle a nd Application
第
一
节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Tech
nology
研究DNA分子中某一种基因的位置
确定两种核酸分子间的序列相似性
检测某些专一序列在待检样品中存在与否
是基因芯片技术的基础
第 二 节
PCR技术的原理与应用
Polymerase Chain Reaction
PCR 技术（Polymerase
chain reaction）
• PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反
序列测定 基因突变分析
几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
实时PCR技术原理
第
三
节
核 酸 序 列 分 析
Nucleic Acid Sequence Analysis
DNA测序的基本战略
设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，
各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的
Biological Chip Technology
一、基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) •指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密 排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样本
进行杂交，杂交后用荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算
4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的 第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增 的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大 的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下， 也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引 发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之 间，所以3′端最好选择T。
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
• 引物（primer）
• 是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点，在核酸 合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点
而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸
以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是 游离的。
DNA自动测序结果举例
第
四
节
基
因
文
库
Gene Library
基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列 的克隆群体。 •基因组DNA文库 (genomic DNA library) •cDNA文库 (cDNA library)
文库构建的基本过程
第 五 节 生 物 芯 片 技 术
目录
基因芯片技术原理
• 大规模集成的固相杂交
• 基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变 性和复性的原理
二、DNA链末端合成终止法
目录
DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析 自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸， 然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳 或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA 片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测 器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
Cycle 1
5 5 5
5
Cycle 2
5 5 5 5
目录
5
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5 5
Cycle 3
5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
目录
PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n
以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片
段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互 补，然后通过定性、定量分析得出待测样品 的基因序列及表达的信息。
基因芯片技术的应用领域
临床疾病的 基因诊断
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
•引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为 过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 •引物GC含量在45%~55%间，Tm值最好近72℃.GC含量（composition）过 高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 •上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度， 即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度， 一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最 佳。
够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中
存在的特定基因，核酸探针既可以是人工合成的寡核苷酸片 段，也可以是基因组DNA片度、CDNA片段全长或部分片段，
还可以是RNA片段。
将一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或 全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结 合，判断是否有同源的核酸分子存在。
• （二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
• 也叫做Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。是一种 将RNA从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维素膜上的方法
• 用于RNA的定性定量分析。
• （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
• 也叫做Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异的蛋白 质， • 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与 膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子 即可。
（4）检测
检测的方法依标记探针的方法而异 放射性同位素标记的探针：需要用放射自显影来检测 其在膜上的位置； 生物素等非同位素方法标记的探针：需要用相应的免 疫组织化学的方法进行检测。
印迹技术的应用
7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠 成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结 构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物 自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的 互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物之间不能有
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理
基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发
生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂
点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而 获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影 即可在X胶片上读出DNA链的序列。
（2）制备探针
基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA
互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因， 也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身， 也可以是由之转录而来的RNA或合成的寡核苷 酸。
（3） 杂交
预杂交：用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结 合位点。 杂交：由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一
溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链
分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之 间形成杂化双链(heteroduplex) 。
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
印迹技术的基本过程
（1）制备样品
从待检测组织样品提取DNA或RNA DNA或RNA经酶切消化 酶切片段的电泳分离 凝胶变性处理后转膜
• （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) • 也叫做Southern 杂交，即DNA-DNA杂交分 析。是研究DNA图谱的基本技术。
•
• •
主要用于基因组DNA、如在基因组中特定基
重组质粒和噬菌体的分析。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析中
因的定位及检测等。
具有重要的价值。
引物设计原则
• 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一 端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一 条DNA模板链互补。 • PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有 效地扩增模板DNA序列。引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成 功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成
连续4个碱基的互补。
• 11. 引物应具有特异性。 • 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如 果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的 实验了。 • 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。 有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏 低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作 克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计 的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次， 尽量去满足条件。
三、PCR的基本反应步骤 变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
优
• 特异性强 • 灵敏度高
点
---- 模板量要求 ng 级水平
• 操作简便快捷；
• 对待检原始材料质量要求较低
PCR的主要用途
目的基因的分离和克隆 基因的体外突变 DNA的微量分析
---- 病原微生物的检测 ------遗传病的检测 法医学（犯罪个体的认定；亲子鉴定
(n 为循环次数)
34× 109
PCR技术的基本原理
• ---- 体外模拟DNA的体内复制
• ---- 严格遵循碱基互补配对原则
DNA体内复制与ຫໍສະໝຸດ BaiduCR的对比
模板 体内复制 DNA DNA
聚合酶
引物
解旋解链 解旋酶
DNA Pol Ⅲ 引物酶 Taq 人工合成DNA
解链酶
PCR 热变性
PCR体系基本组成成分
核
酸
分
子
杂 交
（二）印迹技术
• • 首先由E.Southern于1975年提出的 将在凝胶中分离的生物大分子转移（印迹）或直接放
在固定化介质上并加以检测分析的技术。
• 由于这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，所 以称之为“blotting”,即 “印迹”。
（三）探针技术
探针 (probe) 指带有特殊标记的核酸片段，它具有特定的序列，能
应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引 物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体 外复制DNA的过程。是基于天然DNA复制的原理而设计 的一种在体外由引物介导的DNA酶促合成反应，又称
基因扩增技术。
一、基本工作原理
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过 PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开， 放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的 DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。
核酸序列分析的基本原理
化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
第二十一章
常用分子生物学技术的原理 及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle a nd Application
第
一
节
分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Tech
nology
研究DNA分子中某一种基因的位置
确定两种核酸分子间的序列相似性
检测某些专一序列在待检样品中存在与否
是基因芯片技术的基础
第 二 节
PCR技术的原理与应用
Polymerase Chain Reaction
PCR 技术（Polymerase
chain reaction）
• PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反
序列测定 基因突变分析
几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
实时PCR技术原理
第
三
节
核 酸 序 列 分 析
Nucleic Acid Sequence Analysis
DNA测序的基本战略
设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，
各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的
Biological Chip Technology
一、基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) •指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密 排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样本
进行杂交，杂交后用荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算
4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的 第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增 的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大 的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下， 也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引 发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之 间，所以3′端最好选择T。
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
• 引物（primer）
• 是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起始点，在核酸 合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点
而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸
以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是 游离的。
DNA自动测序结果举例
第
四
节
基
因
文
库
Gene Library
基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列 的克隆群体。 •基因组DNA文库 (genomic DNA library) •cDNA文库 (cDNA library)
文库构建的基本过程
第 五 节 生 物 芯 片 技 术