槐花米中芦丁的提取分离与鉴定

※实验三槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定
芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。

尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。

槐花米为豆科植物槐花的未开放花蕾。

味苦性凉，具清热、凉血、止血之功。

槐花的主要化学成分为芦丁，又名芸香甙，含量可达12-16%。

芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。

为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。

溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。

微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。

芦丁具有维生素P样作用。

可降低毛细管前壁的脆性和调节渗透性，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，临床上用作毛细管脆性引起的出血症，并常用作防治高血压病的辅助治疗剂。

现在国处也常用芦丁作食品及饮料的染色剂。

一、实验目的
1．通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。

2．掌握芦丁的一种提取、精制方法及提制过程中防止甙水解的方法。

3. 掌握黄酮甙水解生成甙元的方法及二者之间的分离。

4．熟悉芦丁、槲皮素的结构性质、检识方法和纸层析鉴定方法。

二、实验原理
本实验主要是利用芸香苷中含有较多的酚羟基，可溶于碱中，加酸酸化后又可析出芸香苷结晶的性质，采用碱溶酸沉法提取，并用芸香苷对冷、热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。

芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通过纸层析鉴定。

芦丁及槲皮素还可通过化学反应及紫外光谱鉴定。

三、实验材料
槐米、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、2％的硫酸溶液、浓盐酸、正丁醇、醋酸、氨水、1％的氢氧化钠溶液、1％的三氯化铝乙醇溶液、1％的葡萄糖溶液、1％的鼠李糖溶液、1％芸香苷乙醇溶液、1％槲皮素乙醇溶液、95％乙醇、碳酸钡、广泛pH试纸、中速层析滤纸等。

四、实验内容
（一）提取：
称取槐米30g，在乳钵中研碎后，投入300ml0.4％硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分钟，在搅拌下加入石灰乳调pH9，煮沸40分钟（注意添加水，保持原有体积，保持pH8~9），趁热倾出上清液,用棉花过滤。

残渣加100ml水，加石灰乳调pH9，煮沸30分钟，趁热用棉花过滤，二次
滤液合并。

滤液保持在60℃，加浓HCl，调pH2-3，放置过夜，则析出芦丁沉淀。

加0.4％硼砂水溶液200ml，在搅拌下加石灰乳调pH值至8~9，加热，煮沸15min，随时补充失去的水分，保持pH8~9，倾出上清液，用四层纱布过滤；同样操作再提取一次。

合并两次滤液，放冷，并用盐酸调pH至2~3，放置过夜，待析出结晶，过滤，滤饼用蒸馏水洗至pH5-6，抽干，置空气中晾干，得粗制芸香苷，称重，计算得率。

（二）精制：
将芸香苷粗品悬浮于蒸馏水中，煮沸至芸香苷全部溶解，加少量活性炭，煮沸5-10分钟，趁热抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤至干，置空气中晾干，或60~70℃干燥，得精制芸香苷，称重，计算得率。

（三）芸香苷的水解：
取芸香苷1g，研碎，加2％硫酸水溶液80ml，小火加热，微沸回流30-60min，并及时补充蒸发掉的水分。

在加热过程中，开始时溶液呈浑浊状态，约10min后，溶液由浑浊转为澄清，逐渐析出黄色小针状结晶，即水解产物槲皮素，继续加热至结晶物不再增加时为止。

抽滤，保留滤液20ml，以检查滤液中的单糖。

所滤得的槲皮素粗晶水洗至中性，加70％乙醇80ml加热回流使之溶解，趁热抽滤，放置析晶。

抽滤，得精制槲皮素。

减压下110℃干燥，可得槲皮素无水物。

(四) 芸香苷、槲皮素及糖的检识
1．颜色反应
①α-萘酚-浓硫酸（Molisch）试验：
取芸香苷少许置于试管中，加乙醇1ml振摇，加α-萘酚试剂2~3滴振摇，倾斜试管，沿管壁徐徐加入0.5ml浓硫酸，静置，观察两层溶液界面变化，出现紫红色环者为阳性反应，表示试样的分子中含有糖的结构，糖和甙类均呈阳性反应，比较芸香苷和槲皮素的不同。

②盐酸-镁粉试验：
取芸香苷少许置于试管中，加5％乙醇2ml，在水浴中加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。

溶液逐渐由黄色变为红色。

③三氯化铁试验
取样品水或乙醇液，加入三氯化铁试剂数滴，观察颜色变化。

④三氯化铝试验：
取芸香苷少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％三氯化铝甲醇试剂2~3滴，呈鲜黄色。

以同样方法试验槲皮素。

⑤醋酸镁试验：
取芸香苷少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％醋酸镁甲醇试剂2~3
滴，呈黄色荧光反应。

以同样方法试验槲皮素（反应也可在滤纸上进行，观察荧光）。

⑥氧氯化锆-枸橼酸试验：
取芸香苷少许置于试管中，加甲醇1~2ml，在水浴上加热溶解，再加2％氧氯化锆甲醇试剂3~4滴，呈鲜黄色。

然后加2%枸橼酸甲醇试剂3~4滴，黄色变浅，加蒸馏水稀释变无色。

以同样方法试验槲皮素进行对照。

⑦氢氧化钠试验：
取芸香苷少许置于试管中，加水2ml振摇，观察试管中有无变化。

滴加1％氢氧化钠溶液数滴，振摇使溶解，呈黄色澄清溶液。

再加入1％盐酸溶液数滴使呈酸性反应，则溶液由澄清转为浑浊状态。

2．色谱检识
(1) 槲皮素和芦丁的薄层鉴定
①聚酰胺薄层色谱：
固定相：聚酰胺薄层板
样品：a精制芦丁b芦丁标准品c精制槲皮素
展开剂：氯仿—甲醇—丁酮—乙酰丙酮：(16：10：5：1)
显色：
a可见光下观察色斑，再于紫外灯下观察荧光斑点
b喷洒AlCl3乙醇液后观察。

②硅胶薄层色谱
吸附剂：硅胶G，105℃下活化2h
展开剂：a.氯仿：甲醇：甲酸（15：5：1）
b.氯仿：丁酮：甲酸（5：3：1）
显色剂：1%FeCl3和1%K3[Fe（CN）6]水溶液，应用时等体积混合。

(2) 芸香苷和槲皮素的纸色谱检识：
支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样品：自制1％芸香苷乙醇溶液
自制1％槲皮素乙醇溶液
对照品：1％槲皮素标准品与1％芸香苷标准品乙醇溶液
展开剂：a. 正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
b. 15％醋酸水溶液
展距：10-15cm
显色：a. 在可见光下观察斑点颜色，再在紫外灯下观察斑点颜色
b. 喷三氯化铝试剂呈黄色斑点
c．经氨气熏后再于可见、紫外下观察。

(3) 糖的纸色谱检识：取上述芸香苷水解后的母液20ml，加入氢氧化钡细粉（约2.6g）中和至pH7，滤除生成的硫酸钡沉淀（可用滑石粉助滤）。

滤液中水浴中浓缩至1~2ml，供纸色谱点样用。

支持剂：新华层析滤纸（中速、20cmХ7cm）
样品：水解浓缩液
对照品：a. 葡萄糖标准品水溶液
b. 鼠李糖标准品水溶液
展开剂：正丁醇：冰醋酸：水（4：1：5上层）
显色：a. 喷苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃加热10min，显棕色或棕红色斑点
b.喷氨性硝酸银试剂，于100℃左右加热，呈棕褐色斑点。

五、实验说明及注意事项
1．本实验采用碱溶酸沉法从槐米中提取芸香苷，收率稳定，且操作简便。

在提取前应注意将槐米略捣碎，使芸香苷易于被热水溶出。

槐花中含有大量粘液质，加入石灰乳使生成钙盐沉淀除支。

pH应严格控制在8-9，不得超过10。

因为在强碱条件下煮沸，时间稍长可促使芸香甙水解破坏，使提取率明显下降。

酸沉一步pH为2-3，不宜过低，否则会使芸香甙形成盐溶于水，降低了收率。

2．提取过程中加入硼砂水的作用：即能调节碱性水溶液的pH，又能保护芸香甙分子中的邻二酚羟基不被氧化，亦保护邻二酚羟基不与钙离子络合，使芸香甙不受损失。

3．芸香甙的提取方法除了用碱溶酸沉法外，还可利用芸香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。

又报道将生产工艺改进为95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后将粗浸膏经除去脂溶性杂质后，用水洗净，过滤，干燥即得芸香甙，可提高收率6．96%，并降低了成本。

因此可根据不同原料采用各种不同方法提取。

4．槲皮素以乙醇重结晶时，如所用的乙醇浓度过高（90％以上），一般不易析出结晶。

此时可于乙醇溶液中滴加适量蒸馏水，使呈微浊状态，放置，槲皮素即可析出。

六、思考题
1．本实验提取过程中应注意哪些问题？
2．根据芸香苷的性质还可采用何种方法进行提取？简要说明理由。

七、参考文献
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2．中国医学科学院药物研究所：中草药有效成分的研究(第一分册)219—225 1972
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