酵母菌的培养和观察

酵母菌的培养和观察

[日期：2007-02-27] 来源：sy 作者：生物实验室[字体：大中小] [dvnews_page]

目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。

实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。

材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。步骤

1．观察酵母菌

（1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。

（2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。

2．培养酵母菌

（1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。

（2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。

注意事项

1．观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其他杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其他杂菌区分开来。

2．发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。

分析和讨论

酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：

1．C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦（有氧呼吸）

2．C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦（缺氧呼吸）

建议培养酵母菌还可以采用下列两种方法。

1．用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养

（1）取10克豆芽放入100毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。在滤液里加5克蔗糖和5毫升乳酸，配成液体培养液。

（2）把鲜酵母半块或老面（发酵后晾干的面粉团）打碎，投入培养液中，放在黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵母菌。

2．用巴斯德培养液培养

酵母菌需要的无机营养来自外界环境。如果在培养液内适当增加氮、磷等元素，效果会更好。巴斯德培养液的配方如下：

蔗糖15克，碳酸铵1克，磷酸氢钾0．2克，磷酸钙0．02克，硫酸镁0．02克，蒸馏水100毫升，培养方法跟上述的相同。

酵母菌是一些单细胞真菌。酵母可以通过出芽进行无性生殖，也可以通过形成子囊孢子进行

有性生殖。无性生殖即在环境条件适合时，从母细胞上长出一个芽，逐渐长到成熟大小后与母体分离。在营养状况不好时，一些可进行有性生殖的酵母会形成孢子，在条件适合时再萌发。

培养酵母最适pH 值为pH4.5-5.0。最适生长温度一般在28℃~30℃之间。

酿酒酵母，用到的培养基有：

1、酵母完全培养基YPD：酵母提取物10g，蛋白陈20g,葡萄糖20g，定容至1L。加入1.5%琼脂粉则成为固定培养基。

2、SC（合成完全培养基）培养基（用于筛选酵母转化子）：YNB（不含氨基酸的酵母氮源）6.7g，葡萄糖20g，加入相应的氨基酸，定容至1L。加入1.5%琼脂粉则成为固定培养基。

由于葡萄糖和氨基酸，灭菌是用115度，30min的灭菌条件。

液体摇菌时一般在30度下摇24－30min，就可以，固体培养一般在30度下要3－5天。

酵母破壁的液氮研磨方法的详细步骤：

取1L酵母，诱导完后，离心（centrifugation）收菌体，称湿重，用蛋白（protein）纯化buffer悬浮菌体，重量（g）：buffer体积（毫升）＝1：1－－1：2。用注射器将菌液加入液氮中，控制加入速度，使得菌液进入液氮中后形成小颗粒,太快容易结成块。将菌体液氮颗粒转入高速打碎器（用的是打碎草药的机器，RMB600）中，注意不要将多余液氮倒入，大约2－3万转/分破碎1分钟，菌体颗粒应该成粉末状。倒出粉末，37度水浴融化后，再用注射器加入液氮中，重复上述步骤，重复3次。高速（20000rpm，4度30分）离心（centrifugation）收上清，如上清杂质较多，需要多离几遍，上清中目标蛋白（protein）纯化同E.coli.