miR―27b在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞上皮间质转化及他莫昔芬耐药中的调控机制word资料6页

miR―27b在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞上皮间质转化及

他莫昔芬耐药中的调控机制

[关?I词] 雌激素受体；乳腺癌；miR-27b；他莫昔芬；HMGB3

[Abstract] Objective To investigate regulation mechanism of miR-27b in epithelial-to-mesenchymal transition and Tamoxifen sensitivity of ER positive breast cancer cells. Methods qRT-PCR was performed to detect miR-27b expression. Dual luciferase assay and Western blot assay were performed to detect the regulative effect of miR-27b on HMGB3 expression. Tamoxifen sensitive （TamS） and tamoxifen resistant （TamR） MCF-7 cells were transfected with miR-27b mimics or HMGB3 siRNA. Then cell viability， the expression of epithelial and mesenchymal markers and cell invasion were measured. Results TamR MCF-7 had approximately 20% of miR-27b expression compared to TamS MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly enhanced the suppressive effect of

4-hydroxytamoxifen on cell viability in TamR MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly inhibited cell invasion in both TamS and TamR cells. In TamR MCF-7 cells， transfection of miR-27b mimics resulted in approximately 3 folds increase of E-cadherin and 70% decrease of N-cadherin. miR-27b could bind to the predicted binding site in the 3′UTR of HMGB3 and decrease HMGB3 expression at protein level. Knockdown of HMGB3 phenocopied the effects of miR-27b.

Conclusion miR-27b can inhibit epithelial-to-mesenchymal transition and sensitize ER positive breast cancer cells to tamoxifen via targeting HMGB3.

他莫昔芬与雌二醇竞争结合雌激素受体（ER），广泛应用于ER阳性乳腺癌术后的辅助治疗[1-2]。虽然他莫昔芬的临床运用显著提高了患者的生存期，但乳腺癌细胞通常会在一段时间治疗后出现他莫昔芬耐药，导致肿瘤复发和治疗失败[1，3]。

研究发现，乳腺癌细胞获得性他莫昔芬耐药通常伴随多种miRNA的异常表达[4-6]。如4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理后，ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞中miR-574-3p表达降低，导致了网格蛋白重链异常升高，从而参与了他莫昔芬耐药[7]。乳腺癌细胞中miR-320的降低可以通过增加cAMP调控的磷酸蛋白（ARPP-19），雌激素相关受体γ及其下游效应分子的表达，包括c-Myc和细胞周期蛋白D1，导致获得性他莫昔芬耐药[8]。有研究指出，miR-27b低表达也与乳腺癌细胞获得性他莫昔芬耐药密切相关[9]。但miR-27b在乳腺癌细胞中的下游调控机制还不是很清楚。本研究拟探讨miR-27b/HMGB3调控轴对ER阳性乳腺癌细胞上皮间质转化和他莫昔芬敏感性的作用。 1 材料与方法

1.1 细胞培养

ER阳性且他莫昔芬敏感（TamS）的乳腺癌细胞MCF-7购自美国ATCC 细胞库。采用低剂量逐步加量法诱导他莫昔芬耐药的（TamR）MCF-7细胞。肿瘤细胞用RMPI-1640培养基培养，添加10% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素/mL和100 μg链霉素/mL。

1.2 细胞转染

miR-27b模拟物（mimics），HMGB3si-RNA（si-HMGB3）和对应的阴性对照购自锐博生物。参考转染试剂Lipofectamie 2000（Invitrogen）说明书进行转染。

1.3 生物信息学预测

使用Target Scan 7.1预测miR-27b和HMGB3的结合位点。

1.4 RNA提取及实时荧光定量

按照TRIzol RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA。应用TaqMan miRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）将RNA逆转录为cDNA。用TaqMan miRNA分析试剂盒检测miR-27b的表达。所有qRT-PCR实验均使用Applied Biosystems 7500实时定量PCR仪进行。RNA的相?Ρ泶锪渴褂?2-ΔΔCT 法计算。

1.5 细胞活力检测

取转染miR-27b mimics或HMGB3 siRNA后24 h的TamS或TamR MCF-7细胞，接种于96孔板（3×103个细胞/孔），继续培养24 h。之后，将培养基换为5 μmol/L的4-OHT培养基。细胞继续培养72 h后进行CCK-8

检测细胞活力。

1.6 Transwell侵袭实验

将基质胶铺于小室底部，小室下层加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液500 μL，上层加入无血清的RPMI 1640培养液100 μL。转染48 h 后，制备细胞悬液，小室上层铺500 μL的细胞悬液（含1×105个细胞），继续培养24 h后，4%甲醛固定、0.1%结晶紫染色后在显微镜下（100×）