第四章微生物培养基的类型及配制

1、增殖培养基
在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜 欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖 速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基 称为增殖培养基。
增菌、运送用培养基
B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B1 0 B1 胆盐乳糖培养基（BL） 亚硒酸盐增菌培养基 亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基 四硫磺酸钠亮绿基础培养基 GN肉汤培养基 碱性蛋白胨水培养基 7.5%氯化钠肉汤培养基 缓冲蛋白胨水培养基 血液增菌培养基 大肠杆菌增菌 沙门氏菌增菌 食品中沙门氏菌增菌 沙门氏菌增菌 志贺氏菌增菌 霍乱弧菌增菌 金黄色葡萄球菌增菌 沙门氏菌增菌 血液中细菌增菌
时才可打开门
进入杀菌锅 之物 品，盖子不可关 太紧或太松
注意事項 – 杀菌锅使用
拿灭菌后物品请记得带耐热手套
培养基配制 – 平板培养基
風扇
UV燈
日光燈
灭过菌之固体培养 基于无菌操作台
(Laminar flow)
內倒制平板培养基 (Plate)
思考题
1、加入培养基中的抑制剂有什么作用，常用的 抑制剂有哪些？ 2、在制备培养基时，将各成 份溶化时要注意哪些问题？ 3、在制备培养 基时，如何进行培养基pH的初步调正？ 4、如何选择培养基的灭菌条件？ 5、如何进行培养基的保存？
食品质量检测技术
第一节 培养基
一、培养基中的主要成分及其作用
（一）、营养物质 N源、C源、无机盐、生长因子、水
1、常用的N源物质
蛋白胨 牛肉膏 肉浸汁 酵母膏
（1）蛋白胨
有： 普通蛋白胨 示胨 胰蛋白胨
（2）、牛肉浸液
成份：
含氮物： 肌酸、嘌吟、核苷酸尿酸肌肽等 糖类物质：葡萄糖、肝糖、P-已糖 生长因子：硫胺、核黄素、泛酸、叶酸等8种B 族维生素
4. 试管傾斜，放入接种环
无菌操作 – 取菌技巧 1
5. 试管前端过
火，盖上试管盖
6. 接种环烧 红灭菌
无菌操作 – 取菌技巧 2
(方法二：plate 反面拿起)
2. 自 Plate 上取单一 菌落 (方法一：盖子微 开遮住培养基，避免空 气中菌体掉入)
无菌操作 – 取菌技巧 3
1. 挤出安全吸 球內空气，插 上灭过菌之玻 璃吸管
4、培养基pH的校正
灭菌后PH值会下降0.1～0.2， 在做培养基校正PH值时，应比实际 值高0.1～0.2； PH调整后，还应将培养基煮沸。
5、培养基的过滤澄清

液体培养基可用滤纸过滤法 琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉 的双层纱布过滤
６、培养基的分装
斜面： 1/５管 半固体培养基：1/3管 高层斜面：1/4～1/3管 平板：13~15ml
5. 慢慢释放按钮，即可 吸取液体
无菌操作 – 错误示范
试管直放，空气中菌体 容易掉入
操作时离火源遙远
无菌操作 – 错误示范
安全吸球倒放，菌液 容易流入吸球內
安全吸球隨意放置桌面，菌 液容易流出至桌上
无菌操作 – 错误示范
Pipetman 倒放，菌液容 易流入 Pipetman 內
注意事項 – 生物性废弃物

2、培养基成分的称取
培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最 好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种 成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取 齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称 取完毕后，还应进行一次检查。

3、培养基各成份的混合和溶化
指示剂应在调节好PH值后再加入； 煮溶后要补加足水份； 不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。
（二）、水
用蒸馏水，不能用自来水
（三）、凝固剂
琼脂、明胶、血清等
要求：清一色、杂质少
（四）、抑制剂
1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率 2、种类： 盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等 染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红 胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸 盐 抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素
3. 药品放回药品柜
培养基配制 – 分装
1. 调整分注器
(Dispensette) 刻度
2. 分装试管
3. 盖上试管盖
培养基配制 – 灭菌
放入杀菌锅
(Autoclave)
灭菌
注意事項 – 杀菌锅的使用
放东西 调整温度时间
加水盖过铁板
关门
关紧泻压伐
注意事項 – 杀菌锅使用
灭菌结束后，等
压力降回零
3、检验操作过程的无菌操作要求
（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作； （2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。 （3）、在正火焰上方操作； （4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌； （5）、在接种培养物时，协作应轻、准。 （6）、致病菌不能用嘴直接吸吹吸管。 （7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于 盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。
8、培养基的质量测试
（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培 养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。 （２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜， 如发现有菌生长，即弃去。 （３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培 养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查 原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培 养基即应弃去，不能使用。

无菌操作
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5) 接种 (6)塞好棉塞
无菌操作 – 取菌技巧 1
1. 接种环前端铁丝部 分以酒精灯烧红 灭菌，后端铁棒 部分过火
无菌操作 – 取菌技巧 1
2. 试管前端过火
3. 打开试管盖
无菌操作 – 取菌技巧 1
1. 以量筒装取适当量蒸 馏水于玻璃容器中
2. 于玻璃容器上标示培 养基名称
培养基配制 – 秤药
1. 放上秤药纸 並归零 2. 以秤药匙舀 出适当量药 品 (请看培 养基配方上 說明)
培养基配制 – 溶解培养基
傾倒培养基時小心 不要沾到玻璃壁上
注意事項 – 配药结束
ห้องสมุดไป่ตู้
1. 清理配药桌面与天平 2. 清洗秤药匙，擦干放回
（五）、指示剂
1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质 和含氮化合物，产酸产碱的能力。 2、常用的指示剂： 酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复 红、伊红、美蓝、孔雀绿等
二、培养基的类型
在实验室中配制的适合微生物生长 繁殖或累积代谢产物的任何营养基质， 都叫做培养基(Media)。由于各类微生 物对营养的要求不同，培养目的和检 测需要不同，因而培养基的种类很多。 我们可根据某种标准，将种类繁多的 培养基划分为若干类型。
7、培养基的灭菌
（1）含糖类或明胶的培养基： 113℃灭菌 15分钟或115℃灭菌10分钟。 （2）无糖培养基： 121℃灭菌15~20分钟。 （3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技 术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养 基中。 （4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃60℃时取出，再摆置成适当斜面。
2. 向上为吸， 向下为放
无菌操作 – 取菌技巧 4
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip (用力插紧)
无菌操作 – 取菌技巧 4
3. 按钮压至第一段 (不 可压至最底)
4. 深入液面下 2 ~ 4 mm
无菌操作 – 取菌技巧 4
生物性废弃物
放至正确位置以 便灭菌
二、微生物的接种与分离技术
（一）、接种

将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物 体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法
接种和分离工具
1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7. 接种锄 8.小解剖刀
常用的接种方法有以下几种：
１）划线接种 ２）三点接种 ３）穿刺接种 ４）浇混接种
５）涂布接种 ６）液体接种 ７）注射接种 ８）活体接种

(二)、分离纯化
１、倾注平板法
２、涂布平板法
倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解
高盐蔡氏琼脂培养基
真菌、酵母菌分离
3、鉴别培养基

在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区 分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助 开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴 别培养基。
鉴别用培养基
名 蛋白胨水培养基 乳糖胆盐发酵培养基 0.5%乳糖发酵培养基 半固体培养基 三糖铁琼脂培养基（TST） 氰化钾基础培养基 脱羧酶试验对照培养基 称 用 途 靛基质和霍乱红试验 大肠杆菌发酵乳糖试验 肠道菌生化试验（复发酵） 动力试验和菌种保存 肠杆菌糖发酵及硫化氢反应 沙门氏菌分离 细菌脱羧酶试验
（三）无菌器材
灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌
衣等. 消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、 天平、工作台、手等
（四）无菌操作
1、目的： （1）是保证待检物品不被环境中微生物的 污染； （2）是防止被检微生物在操作中污染环境 或感染操作人员。
2、进入无菌室前的准备
（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合 规定； （2）、用紫外线灭菌处理30~60分钟； （3）、检查无菌器材是否完备； （4）、洗手消毒； （5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。
（3）、组织浸液
组织浸液，主要为微生物生长繁殖提 供可溶性含氮物质、核酸降解物、维生 素及无机盐等，补充蛋白胨营养成分的 不足部分。包括动物组织浸液、植物组 织浸液、微生物细胞浸液。
2、糖、醇类物质
单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖 双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖 多糖：淀粉、纤维素、菊糖 醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间 （2）无菌室的消毒和防污染 每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）. 每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）. 每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进 行消毒。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台 内四周擦拭干净.

（一）、根据培养基的物理状态来区分
固体培养基 液体培养基 半固体培养基
1、液体培养基
主要用于增菌培养、鉴别性培养
2、固体培养基
用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计 数、保藏、生物测定等
3、半固体培养基
观察微生物的动力，有时用来 保藏菌种。
（二）、根据培养基的用途来区分
增殖培养基
选择培养基 鉴别培养基
9、培养基的保存
（1）基础培养基不能超过两周 （2）生化试验培养基不宜超过一周， （3）选择性或鉴别性培养最好当天使用， 倾注的平板培养基不宜超过3天。
培养基配制 – 器材
培养基、玻璃器皿 天平秤、药匙
培养基配制 – 仪器
杀菌锅 (Autoclave)
无菌操作台 (Laminar flow)
培养基的配制 – 装水
SCDLP液体基础培养基
化妆品中细菌增菌
2、选择培养基

在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要 的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。
分离培养用的培养基
名 SS琼脂培养基 HE琼脂培养基 伊红美蓝琼脂培养基 麦康凯琼脂培养基（MacC） 甘露醇高盐琼脂培养基） XLD琼脂培养基 中国蓝琼脂培养基 碱性琼脂培养基 称 用 途 沙门氏和志贺氏菌属分离 志贺氏菌分离鉴别 大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别 肠道致病菌分离 绿脓杆菌分离鉴别 志贺氏、沙门氏菌分离 肠道菌分离鉴别 霍乱弧菌分离
第二节、微生物检验的基本操作技术
主要内容
无菌技术
M的接种与分离技术
微生物的培养方法
微生物的生长现象与观察
一、无菌技术
（一）什么是无菌技术

指在微生物实验工作中，控制或 防止各类微生物的污染及其干扰的一 系列操作方法和有关措施。
（二）无菌环境
无菌室 无菌柜 超净工作台
（三）培养基制备的基本方法和注意事项






培养基的制备记录 培养基成分的称取 培养基各成份的混合和溶化 培养基pH的初步调正 培养基的过滤澄清 培养基的分装 培养基的灭菌 培养基的质量测试 培养基的保存
1、培养基的制备记录
每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及 其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时 间制备的日期和制备者等。 记录应复制一份，原记 录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发 生混乱。