饲料中氨基酸的测定

（一）测定原理
B、氨基酸的洗脱
氨基酸pH2.2 的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均 在被吸附，但结合强度各不相同。
随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断地吸附、解吸附， 由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小） 吸附强度 有差异。 不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同： 碱性氨基酸 > 芳 香族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羟基氨基酸。 提高流动相pH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离 子交换柱上洗脱下来。 洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性 氨基酸、碱性氨基酸。 氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺 序一定，标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定， 由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。


水解中色氨酸破坏，不能测定。
酪氨酸在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时，被氧化，不能测准。 酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢溴酸作终止剂时被氧化，不能测准。
饲料中氨基酸的测定
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）
（一）蛋白质的水解 C、碱水解
本方法适用于饲料原料、配合饲料和浓缩饲料中色氨酸的测定。 饲料蛋白在110℃，碱的作用下水解，水解出的色氨酸可用离子交换色谱 或高效反相色谱分离、测定。
饲料中氨基酸的测定
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）
（一）蛋白质的水解
A、盐酸水解（常规或直接水解法）
适用范围：饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中除色氨酸、含硫氨基酸以外
的15种氨基酸的准确测定。（为什么是15种？）
样品加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解22～24 h，冷 却后定容、过滤、蒸干。上机测定。
6 饲料中氨基酸的测定
通过酸水解、氧化酸水解和碱 水解等处理方法将结合态氨基 酸变成游离氨基酸 离子交 换树脂、HPLC测定 饲料原料和配合饲料氨基酸含量的测定 （蛋白质形式存在的、游离氨基酸含量）
氨基酸的分析测定
饲料级氨基酸添加剂 （单体制剂含量或纯度测定） 简单的化 学分析
6 饲料中氨基酸的测定
阴离子 （pH>pI）
两性离子 （pH=pI）
阳离子 （pH<pI）
氨基酸的pI从2.77（天门冬氨酸）到10.76（精氨酸）不等。大多在
5～6之间。谷氨酸：3.22；组氨酸：7.59；赖氨酸：9.74。氨基酸 的等电点 不同氨基酸对树脂的亲和力不同，其强弱顺序为：碱性氨基酸>芳香 族氨基酸>中性氨基酸>酸性氨基酸及羟基氨基酸。
饲料中氨基酸的测定
黎观红 江西农业大学wk.baidu.com物科技学院
6 饲料中氨基酸的测定(教材P106)
6.1 概述
氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位，也是蛋白质的分解 产物； 蛋白质营养——氨基酸营养（不是很确切，小肽营养）； 理想蛋白或理想氨基酸模式（畜禽日粮的氨基酸平衡理论）
——饲料蛋白质营养价值评定。
6.2 氨基酸饲料添加剂质量标准与检验
饲料中氨基酸的测定(教材P120-131)
6.3 氨基酸自动分析仪法 （离子交换层析法）
氨基酸自动分析仪：主要由日本 （Hitachi日立系列产品）、美国（贝 克曼（Beckman）公司）、英国（安玛 西亚公司）、德国（安米诺西斯公司） 等国家生产。 氨基酸测定专用仪器，准确度高， 设备昂贵。
RA+B＋ RB＋A+(RA是阳离子交 换剂，B为溶液中的离子或待分离的生物分子）
当[A+]=[B+],[RB]>[RA], 说明 R－ 与B＋的结 合力比A＋大；反之亦然。
对于两性蛋白而言，结合力取决于其等电点以及 溶液的pH值。
饲料中氨基酸的测定
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A、离子交换层析基本原理 1.平衡阶段:离子交换剂与 反离子结合。 2.吸附阶段：样品与反离子 进行交换。 3、4. 解吸附阶段：用梯度 缓冲液洗脱，先洗下弱吸附 物质，后洗下强吸附物质。
5.再生阶段：用原始平衡液 进行充分洗涤，即可重复使 用。
原始缓冲溶液 的反离子
样品溶液中 的离子
梯度液中 的离子
Ion-exchange chromatography
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）
（一）测定原理
B、氨基酸的分离（离子交换树脂分离）
氨基酸：两性电解质，不同氨基酸电离常数各不相同。pH、pI
此过程中，色氨酸全部被破坏，含
天冬酰胺
谷氨酰胺
硫氨基酸被部分氧化损失，大约损
失20～30％。加入巯基乙醇可部分 保护蛋氨酸，提高测值10％～20％
天冬氨酸 谷氨酸
饲料中氨基酸的测定
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）
（一）蛋白质的水解
B、氧化－酸水解
氧化水解法是将饲料蛋白中的含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等) 用过甲酸氧化，然后进行酸解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再经离子交换色谱 分离、测定。 本方法主要适用于含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）的准确分析测定。此方 法还可以测定芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）及组氨酸以外的氨基酸。
饲料中氨基酸的测定
A、离子交换层析基本原理
离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）
和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如
树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；
纤维素－O — CH2— COO-— Na＋
基质 电荷基团
反离子
树脂 －
N+(CH3) —
OH-
饲料中氨基酸的测定
A、离子交换层析基本原理
日立L－8800氨基酸自动分析仪
L-8900氨基酸自动分析仪的内部结构
饲料中氨基酸的测定
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）
（一）测定原理
饲料中氨基酸的测定
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法） （一）测定原理
氨基酸的分离（离子交换树脂分离）：
A、离子交换层析（ Ion Exchange Chromatography ） 基本原理 以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相， 依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同进 行分离纯化的层析方式。
饲料中氨基酸的测定
6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）
（一）测定原理
B、氨基酸的洗脱
用pH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱侧链pKa增大的氨基酸
C、氨基酸与茚三酮反应
分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成 可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。
茚三酮反应