抗原抗体知识

抗原抗体知识

抗原 (antigen, Ag)

¨ 抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和 (或 ) 细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:

–免疫原性:引起机体产生抗体和 (或 ) 致敏淋细胞的特性;

–免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

¨ 根据抗原是否显示免疫原性分为:

–完全抗原:分子量较大,一般在 10kDa 以上,并具有较复杂的化学组成。• 免疫原性最强的是蛋白质抗原, 多糖次之; 脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

–半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。

• 半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。

载体

¨ 通常是具有高度免疫原性的大分子物质, 具有将免疫原性传递给偶联的半抗原能力。

–常用的载体有钥孔血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白 (Ovalbumin, OVA) 等。

–用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团 -NH2、 -COOH 等将半抗原结合到载体上。结合比例为 5kDa 结合 5~25个分子的小肽。

(三)抗体 (antibody, Ab)

1、抗体的概念:

¨ 机体受到抗原刺激后, 由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。

–抗体主要存在于血清内;

–抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。

–免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既 IgG 、 IgD 、IgE 、 IgA 、 IgM 。

2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。

¨ 单克隆抗体:是一个 B 淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

–特异性强、抗体产量高。

¨ 多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后, 从动物血中所获得的免疫血清,是多个 B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

–特异性低,会产生抗体的交叉反应。

–多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。

–抗原与抗体的结合, 要求量保持一定比例, 当抗原或抗体过量时, 是不能聚合成大颗粒。

3、抗体的制备——多克隆抗体的制备

¨ 动物的选择

¨ 佐剂 (adjuvant)

¨ 免疫方法

¨ 免疫剂量

¨ 抗体效价的测定

¨ 放血或定期抽血

(1) 动物的选择

选择什么动物来免疫取决于:

¨ 所需抗血清的量

–小鼠只能提供 1.0~1.5ml 的血液,而山羊能提供几升。

¨ 能供免疫用的抗原量

–小鼠 50mg 足够,而山羊需要几毫克。

(1) 动物的选择 (续 )

¨ 动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。

–例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。

–常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔 (新西兰兔,年轻,健壮,体重在 2.5kg 左右,雄性 ) 为最常用。

(2) 佐剂 (adjuvant)

¨ 一般可溶性抗原注射后, 迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间, 且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中, 常将抗原和佐剂一起注射。¨ 最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为 :

–弗氏不完全佐剂 (Freund's incomplete adjuvant)

–弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant)

弗氏不完全佐剂

(Freund's incomplete adjuvant, FIA)

¨ 是由油剂 (石蜡油或植物油 ) 与乳化剂 (羊毛脂或 Tween80) 混合而成,比例为 1:1、 2:1、 3:1或 5:1,可根据需要而定,通常 2:1。

¨ 使用时与水溶性抗原按 1:1比例充分混合, 使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。

弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)

¨ 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌 (终浓度为 2~

20mg/ml),即成为 FCA 。

¨ 免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后 (油包水 ) 注入动物。–一般首次注射时用完全佐剂乳化, 第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。

佐剂与抗原乳化的方法

¨ 研磨法:适于制备大量的佐剂抗原

–先将不完全佐剂加热, 取 1.73ml 放人无菌玻璃研钵内; 缓缓滴入 0.23ml 活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。

–按同样方法滴人抗原, 每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢, 待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。

¨ 缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法 (续 )

¨ 注射器混合法

–将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个 5ml 注射器内,然后插入三通管内, 交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。

¨ 优点:无菌操作,节省抗原或佐剂。

¨ 缺点:不易乳化,时间长。

佐剂与抗原乳化的方法 (续 )

¨ 快速乳化法:利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。

–将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中, 置于超声波粉碎器上, 粉碎头浸入液面下 0.5cm ,离瓶底 0.5cm 左右,以免打碎离心管。