柱层析法联合提取分离葡萄皮渣中葡萄籽油、花色素和原花青素 修改版

柱层析法联合提取分离葡萄皮渣中葡萄籽油、花色素和原花青素
摘要
选择直径为1.25cm的层析柱，在其中填充葡萄皮渣粉末5g，用石油醚浸泡1小时后，添加石油醚并收集洗脱液共15 mL,然后转换添加70%乙醇溶液并继续收集洗脱液，等乙醇溶液完全置换柱内的石油醚为止（收集的石油醚约20 mL），此时，停止添加洗脱液并关闭开关，材料浸泡1小时后，继续用70%乙醇提取洗脱，收集洗脱液25mL，合并洗脱液，萃取分离，石油醚层液经减压浓缩得到葡萄籽油粗产品，重量法测其含量；分光光度法分别测定下层醇水溶液中原花青素的含量，减压浓缩得到花色素和原花青素粗产品。

关键词
柱层析葡萄皮渣葡萄籽油花色素原花青素
1 前言
葡萄皮渣是葡萄酒工业的下脚料，占全果量的20%以上，果皮和种籽分别占皮渣41.74%和58.26%。

葡萄籽油是从葡萄的种子中提取而得到的，精制后呈漂亮而自然的淡黄色或淡绿色，葡萄籽含油量为14%～17%，含亚油酸为主的不饱和脂肪酸达70%以上，亚油酸是人体不能合成的必需脂肪酸，葡萄籽油具有多种生物学功效，有效预防高血压、血栓、动脉硬化及心脏病。

葡萄皮含有丰富的花色素，而葡萄籽中含原花青素最多，它们都有广泛的生化和药理活性, 如抗氧化、清除自由基、护肝解毒、抗菌及抗癌等功能, 已经成为医药、保健品的重要原料及食品、化妆品的重要添加剂。

然而，在研究和开发葡萄皮渣的资源过程中，人们往往把它们割裂开来，葡萄皮中的花色素很少受到关注。

本实验利用柱层析法实现同时提取三类物质，并希望达到成本低，效率高。

2 实验目的
通过实验，达到提取分离葡萄籽油、花色素和原花青素的目的，为葡萄皮渣的资源开发利用提供可行的实验数据。

3 实验原理
葡萄籽油极性低，易溶于石油醚，花色素是一种花青素苷，易溶于水和乙醇，原花青素是植物体内广泛存在的多酚类化合物，溶于乙醇。

根据相近相溶的原理，先用石油醚提取洗脱葡萄籽油，再70%乙醇溶液同时把花色素和原花青素提取洗脱出来，收集到的洗脱混合液萃取时油类物质在上层石油醚中，花色素与原花青素则留在下层的醇水溶液中，分别减压浓缩得到葡萄籽油和花色素与原花青素的混合物。

采用重量法测定葡萄籽油的含量。

花色素酸性溶液吸收峰波530 nm，摩尔消光系数4.62×104，在一定浓度范围内吸光值和浓度呈线性关系，因此可通过比色法测定其含量;原花青素为无色物质，在可见光区无特征吸收峰，在紫外区有唯一特征吸收峰，最大吸收波长280nm，花色素在紫外光区280nm也有吸收，但吸收值小得多，因此可通过紫外分光光度法测原花青素的含量。

4 实验设备
100ml烧杯100ml容量瓶50ml容量瓶10ml的刻度试管量筒胶头滴管粉碎机玻璃层析柱旋转蒸发仪紫外分光光度计电子分析天平722型分光光度计烘箱干燥机
5实验材料及试剂
5.1 试剂和试剂的配制
5.11 试剂
原花青素对照品、石油醚、无水乙醇、蒸馏水、70%乙醇溶液。

5.1.2 原花青素母液配制
50ug/mL原花青素对照品母液（取5mg原花青素对照品用无水乙醇溶解，并定容至100mL）
5.1.3 盐酸乙醇配制
0.1mol / L盐酸乙醇（取8.3mL浓盐酸用95%乙醇稀释成1L）
5.2 材料处理
葡萄皮渣置50℃烘箱烘干，粉碎过40目筛，置干燥器中备用。

6 实验步骤
6.1 标准曲线的制作
分别取对照品原花青素母液2.00、4.00、6.00、8.00m L于10m L刻度试管中，用无水乙醇定容至10m L，充分摇匀，制得浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml、40ug/ml 系列的标准液，在280nm处测定光密度，以浓度为横坐标，光密度为纵坐标，制作原花青素的标准曲线。

6.2 样品的提取与分离
准确称取5.0g葡萄皮渣粉末，与石油醚同时缓慢装入层析柱中，在装样过程中石油
醚始终保持没过样品，样品在柱中浸泡1小时，以每小时收集20 mL 的速度收集石油醚洗脱液20 mL ，用70%乙醇溶液连续洗脱，以每小时收集25 mL 的速度收集乙醇洗脱液25 mL 。

合并两份洗脱液，萃取分层分离，分别减压浓缩得葡萄籽油和包含花色素和原花青素膏状物。

6.3 产品含量的测定
重量法测定葡萄籽油的含量。

取萃取下层液进行稀释，测花青素的吸光值OD 530、OD 620和OD 650，再计算在OD 530的光密度，计算各份提取液的花色素的含量；测原花青素的吸光值OD 280，根据标准曲线，计算原花青素的含量。

7 计算
7.1 花青素含量计算
()()6206506205301.0OD OD OD OD OD ---=λ
花色素含量（μmol/g ）=41062.4⨯λOD ×m
V ×1000 OD λ：在波长为530 nm 的光密度，
4.62×104：摩尔消光系数，
V ：提取液总体积（m L ），
m ：样品质量（g ），
1000：计算结果换算成μmol 的倍数。

7.2 原花青素含量计算
原花青素含量（mg/g ）=X
V G D V M ****1000 M ：通过标准曲线计算待测样品液原花青素的含量ug/mL
Vx ：待测样品液的取样体积，mL
D ——样品溶液稀释倍数
G ——样品称取的质量g
V ——样品定容的体积,mL
8注意事项
上样前，认真检查层析柱是否有漏和堵的现象，柱上样时要均匀缓慢。

9 经费预算
对照品（40元），乙醇（25元）
参考文献
[1]曾富华. 生物化学实验技术教程[M]. 到北京: 高等教育出版社, 2011: 172~173.
[2]韩寒冰, 周天, 刘杰凤等. 柱层析循环法联合提取脐橙皮中橙皮苷与多糖的工艺研究[J].食品工业科技, 2013, 34(20): 260~264.
[3]傅武胜赵道辉.黄剑锋. 紫外分光光度法测定葡萄籽提取物中的原花青素含量[J]. (食品研究与开发, 2002, 26(6): 90~92.
[4] Han HB, Li H, Hao RL, et al. One-step column chromatographic extraction with gradient elution followed by automatic separation of volatiles, flavonoids and polysaccharides from Citrus grandis [J]. Food Chemistry, 2014, 145: 542–548.。