抗人CD40 mAb 5H6的 125I标记及其与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性

抗人CD40 mAb 5H6的125I标记及其与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生
物学特性
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
作者：罗先富, 章斌, 马泓冰, 汤琳, 周璇, 徐颖, 吴翼伟, 张学光
【摘要】目的: 研究抗人CD40单克隆抗体（mAb）5H6的125I 标记及与卵巢癌细胞株HO8910体外结合的生物学特性。

方法: 氯氨T法125I标记mAb 5H6(125I5H6), 纸层析法测定125I5H6的标记率和放射化学纯度, 三氯醋酸沉淀法分析125I5H6体外稳定性, 细胞结合饱和实验进行Scatchard分析, lindmo法及其改良方法计算125I5H6的免疫活性分数, 细胞结合实验分析125I5H6同HO8910细胞的内化和滞留。

结果: (1)mAb 5H6的125I标记率为（85.4±5.2）％, 放射化学纯度为(99.2±0.5)%。

(2)125I5H6存放于4℃磷酸缓冲液中7 d后其放射化学纯度为(80.3±4.7)%, 在37℃血浆中存放24 h后其放射化学纯度为(95.3±0.8)%。

(3) 125I5H6与HO8910细胞亲和力Kd=(0.711±0.06) nmol/L, 最大结合位点数(Bmax)=(2.17±0.08）×105个/细胞。

(4)125I5H6免疫活性分数
达(38.6±5.4)%。

(5)4℃ 2 h 125I5H6同HO8910细胞滞留率为(89.8±6.0)%, 37℃ 2 h 125I5H6同HO8910细胞内化率达(54.9±2.6)%。

结论: 氯氨T法进行125I5H6标记具有良好的标记率和放射化学纯度, 以及良好的体外稳定性和较高的免疫活性分数, 且125I5H6与HO8910细胞具有很高的亲和力, 可用于动物体内实验。

【关键词】 125I标记氯氨 T法 CD40 卵巢肿瘤单克隆抗体［Abstract］AIM: To prepare iodine125 labeled anti human CD40 monoclonal antibody 5H6 (125I5H6) and investigate the binding properties of 125I5H6 to HO8910 cells in vitro. METHODS: The mAb 5H6 was labeled with Na125I using chloramine T method. The labeling efficiency and radiochemical purity of 125I5H6 were measured by paper chromatography. The stability of 125I5H6 in vitro was monitored by trichloroacetic acid (TCA) precipitation. The dissociation constant (Kd) of 125I5H6 from HO8910 cells and the numbers of maximum binding sites (Bmax) were obtained by Scatchard analysis. Immunoreactivity of 125I5H6 to HO8910 cells was determined by “Lindmo” assay and its improved method. Internalization and retention of 125I 5H6 by HO8910 cells were studied by cell binding experiments. RESULTS: (1)The labeling efficiency of 125I5H6 was （85.4±5.2）% and its
radiochemical purity was (99.2±0.5)% . (2)Radiochemical purity of 125I5H6 was (80.3±4.7)% after 7 days in 4℃ PB (phosphate buffer) and (95.3±0.8)% after 24 hours in 37℃plasma. (3)At 4℃, Kd for 125I5H6 to HO8910 cells was (0.711±0.06) nmol/L and Bmax was （2.17±0.08）×105 sites/cell.
(4)Immunoreactivity of 125I5H6 was (38.6± 5.4)%.
(5)Retention rate of 125I5H6 with HO8910 cells was (89.8±6.0)% after 2 hours at 4℃and internalization rate of 125I5H6 by HO8910 cells was (54.9±2.6)％ after 2 hours at 37℃. CONCLUSION: 125I5H6 possesses good labeling efficiency and perfect radiochemical purity. 125I5H6 has suitable stability in vitro and its immunoreactivity was not low. The high affinity of 125I5H6 with HO8910 cells will benefit further animal study in vivo.
［Keywords］iodine125 labeling; chloramine T method; CD40; ovary tumor; monoclonal antibody
卵巢癌的死亡率高居妇科恶性肿瘤之首, 虽然经过传统的手术、化疗和放射治疗, 病情可获缓解, 但复发率高, 上皮性卵巢癌的总体5年存活率仅30％, 且卵巢癌患者晚期生存质量很差［1］。

近年卵巢癌的免疫治疗成为备受关注的一种新的辅助治疗方法, 采用肿瘤特异性或者相关抗体对卵巢癌进行放射免疫诊断和治疗逐步成为一种新的方法［2］。

CD40分子属于TNF受体超家族成员, 主要表达在B细胞、树突状细胞（DC）、上皮细胞以及一些肿瘤细胞上。

业已表明, 卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等肿瘤细胞株和新鲜肿瘤组织都表达CD40分子, 而通过单克隆抗体（mAb）激发CD40分子不仅可以直接作用于肿瘤细胞, 其介导的信号还可在多个环节影响肿瘤发生、发展［3］。

本所研制的mAb 5H6是鼠抗人CD40新位点mAb, 我们采用氯氨T法进行125I 标记mAb 5H6(125I5H6), 获得了高放射化学纯度、良好体外稳定性和较高免疫活性分数的125I5H6, 为不同放射性碘标记mAb 5H6以及建立放射免疫显像和靶向治疗方法奠定了初步实验基础。

1 材料和方法
1.1 材料卵巢癌细胞株HO8910、人血管内皮细胞株Eahy926 (中国科学院上海细胞研究所) 由本所保存; 鼠源性抗人CD40 mAb 5H6（IgG1）、 5C11（IgG1）均为本所研制。

RPMI1640 培养基（GIBCO 公司, 美国）, 无还原剂Na125I （成都中核高通同位素股份有限公司）, 氯氨T（Sigma公司, 美国）, 偏重亚硫酸钠（Fluka公司, 德国）, Sephadex G25(GE公司, 美国), 其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

CO2培养箱, 离心机(Jouan 公司, 法国), 倒置显微镜(Olympus 公司, 日本), 流式细胞仪(Beckman Coulter公司, 美国), CRC15R型放射性核素活度计(CAPINTEC公司, 美国), SN695B型放免γ测量仪（上海核所日环光电仪器有限公司）。

1．2 方法
1.2.1 mAb 5H6与HO8910细胞特异性结合的检测将细胞HO8910及对照细胞Eahy926调至5×109/L, 分别取100 μL同2 μg 5H6或5C11, 4℃孵育45 min, PBS洗2次, 加入PE羊抗鼠二抗, 4℃孵育45 min, PBS洗2次, 悬浮于0.5 mL PBS中, 进行流式细胞术分析。

1.2.2 mAb 5H6的125I标记及纯化采用氯氨T法［4］对mAb 5H6进行 125I标记: 分取70 μL (0.05 mol/L, pH=7.4) PB液（磷酸缓冲液）, 20 μg 5H6, 1 mCi Na125I, 50 μL（1 g/L）氯胺T 溶液, 混合振荡60 s, 用100 μL （1 g/L）偏重亚硫酸钠溶液终止反应1 min; 将标记液用预先平衡Sephadex G25柱（Ф1×5 cm）纯化, 采用含1 g/L BSA（牛血清白蛋白）的PBS洗脱, 收集洗脱液（0.5 mL/瓶）。

1.2.3 标记率、放射化学纯度测定及稳定性分析采用纸层析法测定抗体标记率和放射化学纯度, 以新华1号层析纸为固定相, 生理盐水为展开剂, 用γ放射免疫计数器测量各段放射性计数, 计算标记率（纯化前标记物峰的计数占各峰总计数的百分比）和放射化学纯度（纯化后标记物峰的计数占各峰总计数的百分比）。

125I5H6在体外的稳定性: 将125I5H6分别存放于4℃ PB液、 37℃生理盐水、 37℃血浆中, 于不同时间点采用100 mL/L TCA（三氯醋酸）沉淀法测定其放射化学纯度。

1.2.4 细胞结合动力学实验分为总结合（total binding, TB）和非特异性结合(non specific binding, NSB)两组。

TB组各实验
管加5×105个HO8910细胞和20 ng125I5H6, NSB组各管则比TB 组多加20 μg未标记抗体5H6（封闭特异性抗原结合位点）, 在室温孵育10 min、 30 min、 1 h、 2 h、 4 h、 6 h, 其中每组每个时间点均设两个平行管, 反应结束时先测各管总投入（total, T）的放射性计数, 离心弃上清, 用含1 g/L BSA的PBS洗涤2次后, 测其沉淀部分即结合的放射性计数, 由TB管沉淀部分的放射性计数减去相应的NSB管沉淀部分的放射性计数可得特异性结合（specific binding, SB）的放射性计数, 并由T减去相应的SB可得未结合即游离部分（free, F）的放射性计数。

1.2.5 细胞结合的饱和实验及Scatchard分析 TB组各实验管加5×105个HO8910细胞和不同终浓度125I5H6, NSB组各管则比TB 组各管多加1 000倍的未标记5H6, 在4℃孵育1 h, 其中每组每个浓度点均设两个平行管。

以125I5H6浓度为横坐标, SB及NSB所对应的125I5H6量为纵坐标, 绘制细胞结合的饱和曲线。

Scatchard分析: 以SB对应的标记抗体的终浓度为横坐标, SB与F 的比值（记作B/F）为纵坐标进行直线拟合, 根据公式B/F=C·Ka-Ka·B(Ka为亲和常数)得出抗体与细胞结合的亲和力（用解离常数Kd＝1/Ka表示）及最大结合位点数（number of maximal binding sites, Bmax）, 其中Ka为拟合直线的斜率, Bmax为拟合直线在x轴上的截距。

1.2.6 免疫活性分数计算采用lindmo法［5］和改良的lindmo 法对125I5H6免疫活性分数分别进行计算。

Lindmo法: 在倍比稀
释的6个不同浓度的HO8910细胞悬液中, 加入20 ng 125I5H6, 室温反应45 min。

另一组非特异结合管, 在加入125I5H6前, 先加入20 μg非标记5H6以封闭特异性抗原结合位点。

以细胞密度的倒数为横坐标, 加入的125I5H6总计数T(代表125I5H6的总浓度［T］)与结合部分计数B(代表结合抗体浓度［B］)的比值［T］/ ［B］为纵坐标作图, 并拟合直线方程, 纵坐标上的截距的倒数即125I5H6的免疫活性分数。

改良的Lindmo法实验步骤同细胞结合的饱和实验, 最后绘图时以总计数［T］为横坐标、［T］/［B］为纵坐标, 作图并拟合直线方程, 纵坐标上截距的倒数即125I5H6的免疫活性分数。

1.2.7 125I5H6同HO8910细胞内化及滞留实验将HO8910细胞贴壁培养于10 cm2的培养皿, 加入1 μCi 125I5H6, 在4℃孵育1 h后用冰冷的培养液洗2次, 再加入2 mL冰冷的培养基, 将培养皿分别置于37℃和4℃下, 于不同时间点收集培养液, 每个时间点设3个复皿。

首先用不同时间点分离的培养液计数来测定从胞膜表面脱落的125I5H6, 然后用冰冷的pH值为2.25的培养液洗2次, 所得洗脱液计数来测定胞膜表面的125I5H6, 最后用胰酶消化下来细胞悬液的计数来测定胞内的125I5H6。

1.2.8 统计学处理数据用x±s表示, 采用SPSS13.0软件包处理, t检验行显著性分析。

2 结果
2.1 mAb 5H6特异性识别HO8910细胞表达的CD40分子 mAb 5H6能特异性结合人卵巢癌细胞株HO8910, 而同型对照抗体和阴性对照
人血管内皮细胞株Eahy926未检测到阳性表达（图1）。

图1 流式细胞术检测抗人CD40 mAb与HO8910和Eahy926细胞的反应性（略）
Fig 1 Reactivity of anti human CD40 mAbs with HO8910 and Eahy926 cells examined by FCM
2.2 125I5H6标记率、放射化学纯度及稳定性经过3次对mAb 5H6标记重复实验得出, 125I5H6标记率为（85.4±5.2）％, 纯化后游离碘 1.5%, 放射化学纯度为(99.2±0.5)%。

体外稳定性分析显示, 125I5H6在4℃PB液中存放7 d后放射化学纯度为(80.3±4.7)%, 在37℃血浆中存放24 h放射化学纯度为(95.3±0.8)%, 而在37℃生理盐水中存放24 h放射化学纯度降为(65.4±4.2)%。

2.3 125I5H6与HO8910细胞体外的结合动力学实验 125I5H6与HO8910细胞的总结合（TB）随孵育时间的延长明显高于非特异性结合(NSB), 因此两者相减而得的特异性结合(SB)亦随时间递增, 尤其在孵育1 h内迅速增加, 2 h后趋于平坦, 表现出明显的时间依赖性。

另外, NSB组也随时间的延长呈线性增加, 由此表明未标记的5H6能竞争性结合HO8910细胞表面的抗原, 从而抑制125I5H6与HO8910细胞的结合（图2）。

图2 125I5H6与HO8910细胞结合动力学曲线（略）
Fig 2 Conjugation dynamics of 125I5H6 to HO8910 cells
2.4 125I5H6与HO8910细胞结合的饱和实验及Scatchard分析在4℃下, 125I5H6与HO8910细胞作用的TB、 NSB和SB都随
125I5H6量的增加而增加, 其中SB符合饱和曲线规律: 当125I5H6低于0.5 nmol/L时, SB迅速增加, 高于1 nmol/L时缓慢增加并趋于平坦, 而NSB则呈线性增加, 无饱和趋势（图3）。

Scatchard分析125I5H6与HO8910细胞的亲和力Kd值为(0.711±0.06) nmol/L, 最大结合位点数（Bmax）为（2.17±0.08）×105个/细胞, 表明125I5H6同HO8910细胞具有很高的亲和力（图4）。

图3 125I5H6与HO8910细胞结合饱和曲线（略）Fig 3 Saturation binding of 125I5H6 to HO8910 cells
图4 Scatchard分析125I5H6与HO8910细胞亲和力及最大结合位点数（略）
Fig 4 Analysis the affinity and Bmax of 125I5H6 to HO8910 cells by Scatchard plot
2.5 125I5H6的免疫活性分数 lindmo法计算125I5H6的免疫活性分数为(38.4±5.3)% (图5), 改良的lindmo法计算125I5H6的免疫活性分数为(35.8±
3.9)% (图6), 两种方法计算值无统计学意义。

图5 lindmo 法计算125I5H6免疫活性分数（略）
Fig 5 Determination of immunoreactive fraction of 125I5H6 by lindmo assay
图6 改良lindmo法计算125I5H6免疫活性分数（略）
Fig 6 Determination of immunoreactive fraction of 125I5H6 by improved lindmo assay
2.6 125I5H6与HO8910细胞的内化及滞留实验 125I5H6与HO8910细胞结合后, 37℃时迅速内化, 2 h内化率达(54.9±2.6)％, 而在4℃几乎不发生内化(图7)。

在37℃时125I5H6在HO8910细胞上的滞留率2 h降到(29.2±1.0)％, 而在4℃ 2 h仍然有(89.8±6.0)%滞留(图8) 。

图7 125I5H6同HO8910细胞的内化曲线（略）
Fig 7 Internalization of 125I5H6 by HO8910 cells
图8 125I5H6同HO8910细胞滞留曲线（略）
Fig 8 Retention of 125I5H6 by HO8910 cells
3 讨论
卵巢癌因缺乏有效的早期诊断方法且易复发而居妇科恶性肿瘤死亡率之首, 故卵巢癌早期诊断和术后追踪的方法成为众多学者关注的问题。

CD40分子首先在上皮性肿瘤中发现, 继而多种肿瘤组织和肿瘤细胞均能检测到CD40分子的表达, 如血液系统肿瘤（CLL、 ALL、 AML、 Hodgkin’s淋巴瘤、 non Hodgkin’s淋巴瘤、多发性骨髓瘤等）、上皮性肿瘤（卵巢癌、膀胱癌、头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌等）以及一些软组织肉瘤。

CD40 分子在肿瘤免疫应答中起着非常重要的作用, 其介导的信号可在多个环节影响肿瘤发生、发展, 如调控细胞增殖/凋亡, 增强其他治疗手段的敏感性, 还能通过调节适应性和固有免疫应答而起到抗肿瘤作用。

目前虽然已研制出CD40人源化抗体, 并且有2株
已进入临床前期［6, 7］, 但CD40的广泛表达将使抗体的临床应用存在很大的副作用。

本所研制的抗人CD40 mAb 5H6 完全不同于已报道的抗人CD40mAb［8］的识别谱, 它能识别多种肿瘤细胞株（HO8910,K562等）以及肿瘤新鲜组织表达的CD40分子, 而不识别血管内皮细胞株Eahy926以及一些正常组织表达的CD40分子, 就可避开CD40的广泛表达给抗体临床应用带来副作用, 显示出潜在的应用价值, 这为利用特异性识别肿瘤细胞表达的CD40分子新位点的mAb 5H6作为靶向诊断和治疗开拓新途径。

我们采用经典氯氨T法对mAb 5H6进行标记获得很高的标记率和放射化学纯度, 同时125I5H6也具有较高的免疫活性分数和良好的体外稳定性, 采用125I5H6同卵巢癌细胞株HO8910结合分析了亲和力和最大结合位点数。

虽然125I5H6的免疫活性分数尚不理想, 主要原因是在标记反应中使用比较强的氧化剂氯氨T, 对抗体有氧化损伤, 因而造成活性的部分丢失, 但是我们初步得出125I5H6能同卵巢癌细胞株HO8910在体外具有很高得亲和力, 可用于体内实验, 提示如使用123I、 125I、 131I等不同核特性的放射性核素标记mAb 5H6, 可望成为卵巢癌放射免疫诊断和治疗的靶向生物导弹。

同时如采用比较温和的标记反应条件如Iodogen法, 或采用间接的金属鳌合法同一些金属性同位素进行标记［9］, 可进一步提高标记抗体活性和稳定性以及在细胞上的滞留作用。

【参考文献】
［1］ Edmonson RJ, Monaghan JM. The epidemiology of ovarian cancer［J］. Int J Gynecol Cancer, 2001, 11(6): 423-429.
［2］ Classe JM, Fontanelli R, Bischof Delaloye A, et al. Ovarian cancer management. Practice guidelines for nuclear physicians［J］. Nucl Med Mol Imaging, 2004, 48(2): 143-149.
［3］ Davies CC, Mason J, Wakelam MJ, et al. Inhibition of phosphatidylinositol 3kinase and ERK MAPK regulated protein synthesis reveals the pro apoptotic properties of CD40 ligation in carcinoma cells［J］. J Biol Chem, 2004, 279(2): 1010-1019.
［4］Greenwood FC, Hunter WM, Glover JS. The preparation of 131I labeled human growth hormone of high specific radioactivity［J］. Biochem J, 1963, 89: 114-123.
［5］ Lindmo T, Boven E, Cuttitta F, et al. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess［J］. Immunol Methods, 1984, 72(1): 77-89.
［6］ Law CL, Gordon KA, Collier J, et al. Preclinical antilymphoma activity of a humanized anti CD40 monclonal antibody, SGN40［J］. Cancer Res, 2005, 65(18): 8331-8338.
［7］ Tai YT, Li X, Tong X, et al. Human anti CD40 antagonist antibody triggers significant antitumor activity against human multiple myeloma［J］. Cancer Res, 2005, 65(13): 5898-5906.
［8］ Zhou ZH, Wang JF, Wang YD, et al. An agonist anti human CD40 monoclonal antibody that induces dendritic cell formation and maturation and inhibits proliferation of a myeloma cell line ［J］. Hybridoma, 1999, 18(6): 471-478.
［9］ Smith Jones PM, Vallabahajosula S, Goldsmith SJ, et al. In vitro characterization of radiolabeled monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate specific membrane antigen［J］.Cancer Res, 2000, 60(18): 5237-5243.。