卵巢癌SKOV3细胞系培养上清液处理巨噬细胞不同时间后对巨噬细胞分化的影响

卵巢癌SKOV3细胞系培养上清液处理巨噬细胞不同时间后对

巨噬细胞分化的影响

宋玉霞;赵涛;张玮璨;郭清;王宏卫;孟桐羽

【摘要】目的探讨卵巢癌SKOV3细胞系培养上清液处理巨噬细胞不同时间后,巨噬细胞分化亚型的改变.方法 Ficoll密度梯度法分离健康成人外周血单个核细胞,GM-CSF诱导为巨噬细胞(M0)后,用对数生长期的SKOV3细胞培养上清液处理为实验组,用1640培养基处理为对照组,分别于培养第7天和第14天光学显微镜下观察巨噬细胞形态变化;流式细胞术检测实验组和对照组在不同时间后巨噬细胞表面细胞因子(CD64、CD163)表达情况.结果培养第7天时,实验组巨噬细胞形态改变明显,细胞突起增加,细胞变细长,对照组细胞形态无明显变化,实验组CD64-M1型巨噬细胞所占比例高于对照组,CD163-M2型巨噬细胞所占比例低于对照组(P＜0.05);培养第14天时,实验组巨噬细胞形态逐渐恢复,对照组细胞形态仍无明显变化,实验组CD64-M1型巨噬细胞所占比例低于对照组,CD163-M2型巨噬细胞所占比例高于对照组(P＜0.05).实验组CD64-M1型巨噬细胞在第7天时M1/M0水平高于第14天,CD163-M2型巨噬细胞在第7天时M2/M0低于在第14天,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 SKOV3细胞培养上清液可改变巨噬细胞形态,激活巨噬细胞免疫反应,随着时间的推移,细胞形态恢复,发生免疫抑制;同时,也可促进巨噬细胞分化,随着时间的推移,亚型也有不同,主要由CD64-M1型巨噬细胞向CD163-M2型巨噬细胞转变.

【期刊名称】《河北医药》

【年(卷),期】2016(038)010

【总页数】5页(P1498-1501,1504)

【关键词】卵巢肿瘤;SKOV3;巨噬细胞;细胞分化

【作者】宋玉霞;赵涛;张玮璨;郭清;王宏卫;孟桐羽

【作者单位】050011 河北省石家庄市第一医院妇产科;050011 河北省石家庄市第一医院妇产科;河北医科大学;050011 河北省石家庄市第一医院妇产科;050011 河

北省石家庄市第一医院妇产科;050011 河北省石家庄市第一医院妇产科

【正文语种】中文

【中图分类】R737.31

上皮性卵巢癌(简称卵巢癌)是女性生殖系统常见的恶性肿瘤。由于缺乏早期特异性症状、无有效的疾病筛查手段，> 70%的病例确诊时已是FIGO Ⅲ/Ⅳ 期的晚期癌症患者，表现为腹腔内广泛播散和转移。慢性炎症能够促进肿瘤的发生发展，并诱发不同类型的癌症。炎症微环境还有利于肿瘤细胞穿过基底膜，进而发生侵袭和转移[1],因此近年来的一些研究集中于肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associateed macrophages，TAMs)。肿瘤相关巨噬细胞作为侵入实体肿瘤中单核细胞群的主要细胞，大量存在于肿瘤血管周围和低氧区，是炎症进展成为癌症的主要桥梁[2]。卵巢癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润数量和卵巢癌预后不良明显相关，逐渐开展了从免疫学角度研究卵巢癌转移和进展的机制。之前一些研究发现，不同分期的卵巢癌患者腹腔巨噬细胞不同亚型所占比例不同，早期卵巢癌患者腹腔冲洗液中以表达M1型巨噬细胞为主，而晚期患者腹水中主要以M2型巨噬细胞占优势[3]。根据“免

疫编辑”学说，免疫系统对肿瘤的作用随肿瘤的进展不断变化，提示我们不同亚型的巨噬细胞在卵巢癌进展中发挥不同的作用，对卵巢癌恶性表型有重要意义。鉴于巨噬细胞在卵巢癌中的重要作用，本项目拟利用细胞培养及流式细胞学等实验技术，

通过构建卵巢癌细胞系SKOV3培养上清与巨噬细胞共培养模型，明确经SKOV3

培养上清培养后的巨噬细胞亚型的变化及巨噬细胞亚型改变与SKOV3培养上清培养时间的关系，探讨卵巢癌细胞系SKOV3上清对巨噬细胞亚型的影响，初步了解卵巢癌进展过程中巨噬细胞亚型的改变，初步筛选出肿瘤上清中的关键分子靶点，为解释卵巢癌的腹腔播散和转移提供新的线索，并为卵巢癌分子靶点的干预策略提供理论基础。

1.1 材料1640培养基，卵巢癌细胞系SKOV3。

1.2 方法

1.2.1 采集健康成人外周血，Ficoll 密度梯度法收集中间层单个核细胞(1 000

r/min， 20 min，23℃)， PBS 重悬后再次离心(800 r/min， 7 min，23℃)。用对数生长期的SKOV3细胞培养上清液处理为实验组，1640培养基处理为对照组。

1.2.2 巨噬细胞培养：细胞以无血清RPMI1640重悬后种于100 mm细胞培养皿，细胞种植密度为1.0×106/ml，培养箱中静置 2 h 使细胞贴壁，用预热的PBS 润洗3次，除去悬浮细胞。加入10%FBS-RPMI1640和GM-CSF，置入

37 ℃,5%CO2培养箱培养，备用。

1.2．3 用对数生长期的SKOV3细胞培养上清分别处理7、14 d：处理不同时间后，光学显微镜下观察巨噬细胞形态变化。

1.2.4 腹腔巨噬细胞(M0)纯度鉴定：以免疫荧光的方式鉴定分离培养巨噬细胞纯度。细胞刮轻刮培养皿收集巨噬细胞，离心收集细胞沉淀1 200 r/min， 5 min，23℃。弃上清，以CD68抗体标记巨噬细胞，37℃，1 h。PBS洗涤3遍，标记

荧光二抗，37℃，1 h。PBS洗涤3遍，Hocest染核5 min。PBS洗涤3遍，荧

光显微镜观察，统计。

1.2.5 SKOV3细胞培养上清培养巨噬细胞：用对数生长期的SKOV3细胞培养上清分别处理M0巨噬细胞7、14 d，同时用1640培养基设立对照组。

1.2.6 巨噬细胞各亚型比例的检测：以CD68作为腹腔巨噬细胞(M0)的表面标记，以CD64作为M1型巨噬细胞的表面标记，以CD163作为M2型巨噬细胞的表面标记。将对照组和实验组不同处理时间的细胞分别收集，取1.0×106个细胞，分

别标记上述荧光抗体，流式细胞学检测M1、M2所占百分比及M1/M0，M2/M0的比例。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 SKOV3细胞培养上清处理7 d的巨噬细胞形态改变明显，如细胞呈多边形或长梭形，形态饱满，胞质丰富，生长旺盛，细胞突起增加，细胞状态良好；处理

14 d的巨噬细胞形态改变不明显，细胞呈圆形，散在排列。说明SKOV3细胞上

清处理巨噬细胞7 d时可改变细胞形态；而处理14 d时对细胞形态改变不明显。见图1。

2.2 流式细胞术检测实验组、对照组不同巨噬细胞亚型所占比例。

2.2.1 2组不同巨噬细胞亚型所占比例比较：培养7 d时，对照组CD64-M1型

巨噬细胞占(15.4±2.3)%，CD163-M2型巨噬细胞占(2.0±0.7)%；实验组CD64-

M1型巨噬细胞占(24.2±2.9)%，CD163-M2型巨噬细胞占(1.4±0.5)%；培养14

天时，对照组CD64-M1型巨噬细胞占(3.8±0.9)%，CD163-M2型巨噬细胞占(3.3±1.3)%；实验组CD64-M1型巨噬细胞占(1.9±0.9)%，CD163-M2型巨噬细胞占(11.5±1.4)%。2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图2。

2.2.2 2组不同巨噬细胞亚型比值比较：CD64-M1型巨噬细胞在第7天时

M1/M0=(1.61±0.29)，在第14天时M1/M0=(0.52±0.13)；CD163-M2型巨噬细胞在第7天时M2/M0=(0.73±0.19)，在第14天时M2/M0=(3.56±1.10)；差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2，图3。

卵巢癌是致命性最高的妇科恶性肿瘤[4]。我国卵巢癌发病虽位于女性肿瘤第三位，