分子生物学—同源重组、位点专一性重组、转座

同源重组

遗传交换、染色体上基因重排、断裂DNA的修复（1）同源重组的形式

⏹常发生在同源染色体之间（分子间重组）

⏹也可发生在同一DNA分子内（分子内重组）

（2）Holliday 模型

解释同源重组的一个经典模型

基于重组过程中有十字形的中间产物

（3）RecBCD重组途径

存于E. coli中，需要RecBCD蛋白（RecBCD protein，recB、recC、recD基因的产物）参与DNA损伤造成的双链断裂以及外源DNA线性分子的DNA断端。

RecBCD是一种具多功能的酶，依赖于DNA的ATPase(水解ATP, 为DNA的解螺旋提供能量)；DNA helicase; DNA nuclease,可作用于单链或双链DNA, 切割χ位点（GCTGGTGG）χ(chi): crossover hotspot instigator RecBCD的切点与底物的序列有关，可在χ位点3’端4 ~ 6 nt

RecA ：38 kD 的蛋白质，具多种功能，在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是一单链与一双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP。

RuvA和RuvB ：RuvA和RuvB均具DNA helicase活性，RuvB还有ATPase活性；RuvA特异性识别并结合到Holliday junction，并促使RuvB蛋白结合到这一位点；RuvB水解ATP，提供能量，促使分支迁移

RuvC ：解开Holliday junction的核酸内切酶，特异地与Holliday junction结合，在特异位点切开Holliday junction。RuvC是二聚体，有2个活性位点，能切开Holliday junction的两条链，切割位点有特异的序列，必须等branch migration 到达特异序列后，RuvC才能起作用，以何种方式解开Holliday junction取决于RuvC切割位点在两对同源单链上的频率。

（4）减数分裂重组（meiotic recombination）

真核生物中常见的重组，与细菌中的重组有不少相似之处，但在起始的步骤有较大的差异，涉及DNA双链断裂（double-stranded DNA break，DSB）

Spo11：核酸內切酶，能在染色体DNA上产生双链断裂而启动减数分裂重组；DNA切割必须发生在已复制的同源染色体开始配对的时候；DNA切割位点没有序列特异性，但是多分布在核小体包装疏松的染色体区域（如启动子区）

（5）基因转换（gene conversion）

多见于真核生物，当两相似的序列（等位基因、非等位基因均可）靠在一起时，就有可能发生基因转换，即一DNA序列转换成另一相似的序列，基因转换的机制是基于重组，即先交换一段DNA序列，再进行修复，就会使某一序列的比例增加。

位点专一重组

（1）λ噬菌体的整合与切除

1、λ噬菌体整合到宿主基因组

整合酶（Int，λ的int基因编码）

整合宿主因子（integration host factor，IHF）

同源区域attP（λ）与attB（宿主）的重组

2、λ噬菌体从宿主基因组切除

Int、切除酶（Xis，λ的xis基因编码）

整合宿主因子（integration host factor，IHF）

整合的逆过程

3、附着（整合）位点（att sites）

attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15 bp，称为O）

attP的必需序列为235 bp（从–152到+82,以O的中点为0），而attB必需序列约为25 bp（从–12到+12 ）

（2） P1噬菌体的Cre/loxP 重组系统

⏹ Cre

E. coli P1噬菌体cre 基因编码的重组酶，功能是在侵染过程中环化线性的噬菌体DNA

识别并催化两个loxP 位点间的重组

⏹ loxP

34 bp 的回文序列结构，包括被8 bp 间隔的 两个13 bp 反向重复

每个反向重复及其邻近的4 bp 构成一个Cre 亚基的结合区

⏹ 条件型基因敲除

loxP 位点置于待敲除目标基因的两侧

cre 基因置于特异性启动子或调节基因的控制下

转座

（1）细菌转座子

插入序列（insertion sequences，IS）：最简单的转座子，只含有转座必需的元件；两端有反向重复序列（inverted repeats, 15 ~ 25 bp）；中间有编码转座酶（transposase）的基因（至少2个）；插入序列在转座时，其插入位点两旁会产生一小段正向重复（direct repeats）。

带有抗生素抗性基因的转座子,除了必需的转座元件，还含有抗生素抗性基因，能赋予其携带者某种抗性.

转座的机制:

复制型转座（replicative transposition）:转座过程有DNA复制，一个转座子留在原位，另一个插入到新的位点

非复制型转座（nonreplicative transposition ）:转座子离开原位置，插入到新的位点

保守型转座（conservative transposition）

（2）真核生物的转座子

玉米的Ds（dissociation）和Ac（activator）:最早发现（1940s）的转座子，引起某些品种的玉米种子上的色斑变化.

⏹玉米种子的颜色由C基因编码的色素造成;若C基因突变，没有色素合成，种子几乎白色;若部分细

胞产生回复突变，就会在种子上形成颜色斑点

⏹Ac能自行转座，而Ds必须要有Ac的帮助才能转座;Ac与细菌的转座子相似，约4500 bp，两端有反

向重复序列，中间含有转座酶基因;Ds是Ac的衍生物，有Ds-a、Ds-b、Ds-c3种（功能不全，不能

自主转座）

反转录转座子（retrotransposons）:含有编码反转录酶的基因，能进行反转录，以RNA作为中间体进行复制（转座）; 酵母的Ty（transposon yeast）、果蝇的copia等反转录转座子的两端有长末端重复（long terminal repeats，LTRs），转座方式类似反转录病毒（retroviruses）复制.