液体活检
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—— “三驾马车”：CTC、ctDNA 和外泌体
液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医疗”代表性的诊断技术。作 为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技术，液体活检正进入发展的黄金时期，
分子医学时代的入口 CTC、ctDNA 和外泌体的差异
• ctDNA
超用复 早药发 预指监 警导控
精准医疗：Precision Medicine Initiative ࣁ 在恰当的时候给患者以精准的治疗 Delivers the right treatment at the right time
对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史转变！
3
分子医学时代的入口 液体活检，分子医学的入口
荧光定量PCR
数字PCR
NGS测序
中通量 数十个点检测 灵敏度高
低通量 数个点检测 灵敏度最高
高通量 上万个点检测 应用前景广阔
ctDNA临床应用瓶颈
NGS在ctDNA上应用的难点
假阳性问题：需要纠错技术
1. NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误千分之几，甚至百分 之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的“假突变”。 2. 多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。 3. DNA上遗传SNP的干扰。
捕获建库+单分子标签
目前主流，技术相对成熟，>90%研究者采用该方案，代表公司如Guardant Health、Foundation、Roche、
吉因加、燃石等
主要特点：DNA探针或RNA探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无
法检测断裂点附近的突变位点
单链成环＋单分子标签
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的临床应用
无创、全面、实时、便捷
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA指导用药
CAPP-Seq NGS用于血浆ALK&ROS1融合检测
1. 8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1融合
2. 接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小 -- AM. Newman,et al.Nat Med 2014
1. 分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的ctDNA和活体组织切片 -- J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86 2. 血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配
ctDNA的研究进展和临床应用
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA检测平台
CTC的研究进展和临床应用
CTC的来源
CTC的研究进展和临床应用
CTC的研究进展和临床应用
CTC的研究进展和临床应用
疗鉴早 效别癌 监诊发 控断现
• CTC
药 转 预 • 中晚期癌症指标，目前主要用于预后 物 移 后 • 新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC 选 分 评 • 正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择 择析估 • 稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步
分子医学时代的入口
漏检问题：需要补救技术
1. 技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90%片段信息； 2. 超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA片段遗失； 3. 断裂点附近的突变，在靶向富集后多重PCR中无法扩增； 4. 分析过程中无法分辨真实突变，真突变被舍弃。
Hale Waihona Puke BaidutDNA临床应用瓶颈 ctDNA靶向测序建库方法
Ion Ampli-seq
ABI公司独有技术，通过多重PCR靶向扩增目的片段，能够以FFPE gDNA和血浆cfDNA为模板进行建库 主要特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位 点过多可能需要分多个引物pool，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。
• Exosomes
• 活细胞分泌，40-100nm，1个 活细胞状况实时监控指标 • 母细胞来源标志物（RNA／蛋 白质），可用于早期诊断 • 稳定，含量较高，内容物多样 性，受干扰因素少 • 检测相对简单
• 死细胞释放，杀伤性治疗效果 的实时监控指标 • ctDNA是一组Panel，癌变标志 物，没有组织特异性和无癌症 分期的区分 • 不稳定，含量较低，受干扰因 素多
组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物 CTC预后评估
ctDNA的研究进展和临床应用
ctDNA的来源
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的特征
• 标志组合（panel）
每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同ctDNA，包含不同的突变。
• 不断演变及变化
每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变化。 • 高度碎片化 碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。 • 含量少且变化大 cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%； • 超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性
非主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和康、安可济等
主要特点：DNA分子单链成环，RCA扩增或多重PCR扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以
增加位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率，单背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受限）
小结
• ctDNA检测技术尚在不断发展中，还需要提升精准度，避免假阳性，减少漏检； • 临床大样本验证ctDNA技术和检测panel，包括从泛癌种到单肿瘤，尤其是肺癌 等常见癌症的ctDNA检测panel的逐步临床转化； • 除个体化治疗上的机会，更大的机遇上应放在预防和康复领域。
ctDNA的研究进展和临床应用
ctDNA预后评估
1. ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。 2. ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。 -- Breast Cancer Res Treat,2015,March
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA动态监测
液体活检-肿瘤防治利器
Outlines
分子医学时代的入口
ctDNA的研究进展和临床应用
CTC的研究进展和临床应用
分子医学时代的入口
分子医学时代的来临
• • 2006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤异常谱型，是“人类基因 组计划”后又一重大科学研究。 2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包括致癌突变、甲基化和基 因copy数变化等数据。
CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用
血浆甲基化标志物 血清蛋白标志物 血清外泌体miRNA标志物 血清/尿液外泌体蛋白 尿液外泌体RNA标志物 标志物 （早癌诊断、鉴别及疗效判断）（中晚期诊断及疗效判断）
ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel （早筛预警及现实风险评估）
液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医疗”代表性的诊断技术。作 为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技术，液体活检正进入发展的黄金时期，
分子医学时代的入口 CTC、ctDNA 和外泌体的差异
• ctDNA
超用复 早药发 预指监 警导控
精准医疗：Precision Medicine Initiative ࣁ 在恰当的时候给患者以精准的治疗 Delivers the right treatment at the right time
对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史转变！
3
分子医学时代的入口 液体活检，分子医学的入口
荧光定量PCR
数字PCR
NGS测序
中通量 数十个点检测 灵敏度高
低通量 数个点检测 灵敏度最高
高通量 上万个点检测 应用前景广阔
ctDNA临床应用瓶颈
NGS在ctDNA上应用的难点
假阳性问题：需要纠错技术
1. NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误千分之几，甚至百分 之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的“假突变”。 2. 多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。 3. DNA上遗传SNP的干扰。
捕获建库+单分子标签
目前主流，技术相对成熟，>90%研究者采用该方案，代表公司如Guardant Health、Foundation、Roche、
吉因加、燃石等
主要特点：DNA探针或RNA探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无
法检测断裂点附近的突变位点
单链成环＋单分子标签
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的临床应用
无创、全面、实时、便捷
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA指导用药
CAPP-Seq NGS用于血浆ALK&ROS1融合检测
1. 8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1融合
2. 接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小 -- AM. Newman,et al.Nat Med 2014
1. 分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的ctDNA和活体组织切片 -- J Clin Oncol.2014 Feb 20;32(6):579-86 2. 血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配
ctDNA的研究进展和临床应用
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA检测平台
CTC的研究进展和临床应用
CTC的来源
CTC的研究进展和临床应用
CTC的研究进展和临床应用
CTC的研究进展和临床应用
疗鉴早 效别癌 监诊发 控断现
• CTC
药 转 预 • 中晚期癌症指标，目前主要用于预后 物 移 后 • 新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC 选 分 评 • 正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择 择析估 • 稳定但含量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步
分子医学时代的入口
漏检问题：需要补救技术
1. 技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90%片段信息； 2. 超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA片段遗失； 3. 断裂点附近的突变，在靶向富集后多重PCR中无法扩增； 4. 分析过程中无法分辨真实突变，真突变被舍弃。
Hale Waihona Puke BaidutDNA临床应用瓶颈 ctDNA靶向测序建库方法
Ion Ampli-seq
ABI公司独有技术，通过多重PCR靶向扩增目的片段，能够以FFPE gDNA和血浆cfDNA为模板进行建库 主要特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位 点过多可能需要分多个引物pool，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。
• Exosomes
• 活细胞分泌，40-100nm，1个 活细胞状况实时监控指标 • 母细胞来源标志物（RNA／蛋 白质），可用于早期诊断 • 稳定，含量较高，内容物多样 性，受干扰因素少 • 检测相对简单
• 死细胞释放，杀伤性治疗效果 的实时监控指标 • ctDNA是一组Panel，癌变标志 物，没有组织特异性和无癌症 分期的区分 • 不稳定，含量较低，受干扰因 素多
组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物 CTC预后评估
ctDNA的研究进展和临床应用
ctDNA的来源
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA的特征
• 标志组合（panel）
每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不同ctDNA，包含不同的突变。
• 不断演变及变化
每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变化。 • 高度碎片化 碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。 • 含量少且变化大 cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%； • 超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性
非主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和康、安可济等
主要特点：DNA分子单链成环，RCA扩增或多重PCR扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以
增加位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率，单背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受限）
小结
• ctDNA检测技术尚在不断发展中，还需要提升精准度，避免假阳性，减少漏检； • 临床大样本验证ctDNA技术和检测panel，包括从泛癌种到单肿瘤，尤其是肺癌 等常见癌症的ctDNA检测panel的逐步临床转化； • 除个体化治疗上的机会，更大的机遇上应放在预防和康复领域。
ctDNA的研究进展和临床应用
ctDNA预后评估
1. ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。 2. ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。 -- Breast Cancer Res Treat,2015,March
ctDNA的研究进展和临床应用 ctDNA动态监测
液体活检-肿瘤防治利器
Outlines
分子医学时代的入口
ctDNA的研究进展和临床应用
CTC的研究进展和临床应用
分子医学时代的入口
分子医学时代的来临
• • 2006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤异常谱型，是“人类基因 组计划”后又一重大科学研究。 2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包括致癌突变、甲基化和基 因copy数变化等数据。
CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用
血浆甲基化标志物 血清蛋白标志物 血清外泌体miRNA标志物 血清/尿液外泌体蛋白 尿液外泌体RNA标志物 标志物 （早癌诊断、鉴别及疗效判断）（中晚期诊断及疗效判断）
ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel （早筛预警及现实风险评估）