实验中常用蛋白检测方法

研究某分子A在椎间盘退变中作用 •椎间盘标本 切片，HE，特殊染色 免疫组化
基质、退变酶、目的蛋白 WB
•细胞 常规蛋白 WB，免疫荧光 分泌蛋白 ELISA 蛋百度文库分子多 ELISA
•动物实验 免疫组化/免疫荧光
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3种蛋白检测水平的比较
蛋白检测方式 相同点 样品类型
分析方式
不同点 观察结果
免疫组化法
Western blot法
ELISA试剂盒法
抗体-抗原结合反应
组织或细胞
组织或细胞
血清、血浆、尿液、
细胞或组织培养上清
液
定位、定性及定量的研究 可以用于定性和半定量， 多用于定量分析，其
(主要是定位，定位敏感性 定量较免疫组化法准确
目前多用proreinA预先结合固化在琼脂糖微珠上，Protein A是一种金黄 色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体的Fc区结 合，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，琼脂糖微珠上的proreinA/G 与抗体Fc特异性结合，由于抗体抗原特异性，沉淀蛋白X；溶液中有和 蛋白X相互作用的物质，就能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标 蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭 档。
灵敏度非常高
远远高于Western blot法)
免疫组化图（膜阳性、质阳 电泳图（着色的位置和
性和核阳性）
着色深度）
蛋白浓度
应用范围
组织标本，细胞中蛋白交互 检测蛋白质特性、表达 作用以及信号通路。 的一种最常用的方法。 组织、细胞。
分泌性蛋白检测
蛋白的交互作用
寻找目标蛋白
验证两蛋白间作用
验证蛋白交互作用方法
经典的方法有：
CO-IP GST-pulldown 酵母双杂交系统
CO-IP，又叫免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多 蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免 疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Z也能沉淀下来。
免疫组化/免疫荧光
• 原理：抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学 反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色 来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及 定量的研究。
• 特点：是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术 （组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反 应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来 对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。 样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质
ELISA
• 原理：酶联免疫法，它的中心就是让抗体 与酶复合物结合，然后通过显色来检测。
• 特点：免疫学原理和化学反应显色，待测 的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组 织培养上清液，需将抗原或抗体结合到固 相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体 -酶-底物复合物粘附在载体上，这就是 “吸附”的含义。
Pull-down实验
• 跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的， 在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这 还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B， 这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。要证明直接的结 合就是Pull-down实验。提纯所要研究的两个蛋白（一般是在 BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白 一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用 GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另 一个蛋白的存在。
蛋白的检测方法
Western Blot
免疫组化
免疫荧光
ELISA
Western Blot
• 原理：经过PAGE分离的蛋白质样品，转移 到PVDF膜上（以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学 活性不变）。以固相载体上的蛋白质或多 肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色、化学发光或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋 白成分。