免疫学检测技术的基本原理及其应用

流式细胞仪工作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ理
酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA)
用酶（常用辣根过氧化物酶，即HRP或碱 性磷酸酶，即ALP) 标记的抗体与相应抗原 反应。通过酶作用于底物后显色来判定结 果。
常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫 组化法，前者测定可溶性抗原或抗体， 后 者测定组织中或细胞表面的抗原。
酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay, ELISA)
是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 （聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原 抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将 液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹 心法、间接法等。
ELISA 检测抗体
放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)
抗原抗体的检测方法
凝集反应 沉淀反应 中和反应 用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应
凝集反应 (Agglutination)
细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结 合、凝集的现象。
1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗 体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集 现象。又分为玻片法（定性试验）和试管 法（半定量试验）。
(1)抗凝 静脉血
(2)加等 量NS
(3) 混匀后，缓 慢加于分离液上
(4)密度梯度离心
血浆
PBMC 分离液 PMN RBC
T细胞功能测定
体外法：T细胞增殖试验 形态学检查 3H-TdR掺入法 MTT法
体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。 OT-PPD皮试
淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图
间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结 合，再用荧光素标记的二抗染色。优点 ：敏感性比直接法高，制备一种荧光素 标记的二抗可用于多种抗原的检测。
补体结合免疫荧光法：在间接法的第一 步抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗 原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的 抗C3抗体进行示踪。
间接免疫荧光法示意图
特点：需时较短，用于快速沉淀标本中 抗原含量的测定。
火箭电泳示意图
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标 记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。 能极大地提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性或定位检测。
三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶 技术和同位素标记技术。
免疫荧光显微技术 (Immunofluorescence
Technique)
将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITC、藻红 蛋白，PE) 与抗体连接成荧光抗体，再与 待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观 察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本 中抗原的鉴定和定位。
包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。
直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作 标本染色。优点：是特异性强。缺点： 每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗 体。
用放射性核素标记抗原进行的免疫学检 测技术。放射性核素显示的高灵敏性， 使检测的敏感性达pg水平。
常用于标记的放射性核素有I125和I131。 常用于胰岛素、生长激素、药物等微量
物质的测定。
免疫印迹法（Immunoblotting）
将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电 泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶 免疫、放射免疫等技术测定。
培养液
PHA
3H-TdR
淋巴细胞 离心
过滤
测量放射性 全血
分层液
细胞毒试验（51Cr释放法）示意图： （Na51CrO4标记靶细胞）
靶细胞
51Cr
洗涤
去除游离 的51Cr
效应细胞
测量上清液中 释放的51Cr
细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）
正常情况下，乳酸脱氢酶（LDH）存在于 细胞内，细胞损伤时，细胞膜通透性增加， LDH释放，酶促显色反应。
特异性结合阶段；
可见的反应阶段。 是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体 两者的分子浓度和比例密切相关。
抗原抗体比例对反应现象的影响
抗原-抗体反应的影响因素
1.电解质：抗原-抗体反应通常应用 0.85%的氯化钠（适当浓度的电解质） 作为稀释液。
2.温度：反应常在37℃水浴或孵育箱中 进行。
3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度 为PH6-8。
酶联免疫斑点法 （Enzyme-Linked Immunospot,
ELISPOT) 在ELISA的基础上建立的检测抗体
生成细胞及细胞因子产生细胞的方法
。
加入淋巴细胞
抗原包被的反应板 加入酶标记二抗
加入底物
T细胞产生CK的检测
加入淋巴细胞 CK
CK抗体包被的反应板 加入酶标的CK抗体
加入底物
检测抗原特异性B细胞
免疫学检测技术的基本 原理及其应用
2020年4月25日星期六
提要
免疫学检测技术主要应用： 对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发
病机制探讨; 对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘
附分子或细胞受体等的定性、定量检测。
第一节 抗原或抗体的检测
抗原-抗体反应包括： 沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结
凝集反应 (Agglutination)
2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞 或乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒，与相应 抗体反应出现的颗粒凝集现象。
血球凝集
沉淀反应 （Precipitation)
• 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可 溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，称 为沉淀反应。
沉淀反应 （Precipitation)
• 常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性 分析的检测。
勇于开始，才能找到成 功的路
免疫电泳 （Immunoelectrophoresis)
• 将待测血清标本作琼脂 凝胶电泳，不同分子量 蛋白组分开，然后与电 泳方向平行挖一小槽， 加入相应的抗血清，与 不同区带的蛋白抗原作 双向免疫扩散，在各区 带相应的位置形成沉淀 弧。
勇于开始，才能找到成 功的路
• 常用于测定血清IgG、
IgM、IgA 和 C 3等的含 量。
双向免疫扩散 （Double Immunodiffusion)
• 将抗原与抗体分别加入琼 脂凝胶的小孔中，二者自 由扩散并相遇，在比例合 适处形成沉淀线。
• 含两种以上的抗原抗体系 统，可出现两条以上的沉 淀线。
MTT(四甲基偶氮唑盐）法
原理： 在细胞培养终止前数小时加入MTT，活
细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生 紫褐色甲攒（Formazan)沉积于细胞内或 细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成 正相关。
能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分 子量。常用于检测多种病毒（如HIV） 的 抗体或抗原。
免疫印迹法示意图
第三节 免疫细胞的检测
检测各种淋巴细胞的数量与功能是观察 机体免疫状态的重要手段。
外周血是病人主要的检测标本，但仅代 表再循环的淋巴细胞。
实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作 为标本进行检查。
合反应、中和反应等。 抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测
未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的 抗体。
第一节 抗原或抗体的检测
免疫标记技术包括： 免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标
记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金 技术等。
抗原-抗体反应的特点：P226
抗原-抗体的特异性结合。 抗原抗体分子表面的非共价键结合。 反应的两个阶段：
• 常用于血清蛋白种类分 析。
勇于开始，才能找到成 功的路
火箭电泳 （Rocket Electrophoresis)
也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电 泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体 的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时 间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内 ，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。
• 沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀 。
• 大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为 介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。
单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion)
• 将一定量已知抗体混于琼 含抗体的凝胶 脂凝胶中制琼脂板；打孔 ，将抗原加入孔中扩散。
沉淀环
• 抗原与抗体相遇，形成沉 淀环，环的直径与抗原含 量成正比。
免疫荧光显微技术
流式细胞术
（Flow Cytometry, FCM)
FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞 仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体） 进行快速、精确的分析和自动检测，并将不 同类型的细胞分选收集。
FCM还可对同一细胞的多种参数（如 DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多 信息分析。
淋巴细胞转化试验（形态学示意图）
原理： T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外
受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代 谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细 胞的功能。
PHA刺激
48~72小时
淋巴细胞增殖—3H-TdR掺入法
原理： 将单个核细胞中加入PHA共同培养，在
终止培养前8-15小时加入氚标记的胸腺嘧 啶核苷（3H-TdR), 经β-液体闪烁仪检测淋 巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴 细胞增殖的程度。