免疫学检测技术的基本原理及其应用
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抗原抗体比例对反应现象的影响
抗原-抗体反应的影响因素
1.电解质:抗原-抗体反应通常应用 0.85%的氯化钠(适当浓度的电解质)作 为稀释液。 2.温度:反应常在37℃水浴或孵育箱中 进行。 3.酸碱度:抗原-抗体反应适应的酸碱度 为PH6-8。
抗原抗体的检测方法
凝集反应
沉淀反应
火箭电泳 (Rocket Electrophoresis)
也称免疫扩散,是把单向免疫扩散同电 泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体 的琼脂中泳动,两者比例适宜时,在较短时 间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内, 沉淀峰的高度与抗原含量成正比。 特点:需时较短,用于快速沉淀标本中 抗原含量的测定。
2、间接凝集:将可溶性抗原包被在红细胞 或乳胶颗粒表面,形成致敏颗粒,与相应 抗体反应出现的颗粒凝集现象。
血 球 凝 集
沉淀反应 (Precipitation)
血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸 液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现 沉淀物,称为沉淀反应。
沉淀反应 (Precipitation)
沉淀反应可在液体中进行,如絮状 沉淀。 大多数沉淀反应是用半固体琼脂凝 胶为介质,进行琼脂扩散故也称免疫扩 散。
中和反应
用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应
凝集反应 (Agglutination)
细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结
合、凝集的现象。
1、直接凝集:将细菌或红细胞与相应的抗
体直接反应,出现细菌凝集或红细胞凝集
现象。又分为玻片法(定性试验)和试管
法(半定量试验)。
凝集反应 (Agglutination)
流式细胞仪工作原理
酶免疫测定 (Enzyme Immunoassay, EIA)
用酶(常用辣根过氧化物酶,即HRP或碱性 磷酸酶,即ALP) 标记的抗体与相应抗原反 应。通过酶作用于底物后显色来判定结果。
常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫 组化法,前者测定可溶性抗原或抗体, 后 者测定组织中或细胞表面的抗原。
将荧光素(异硫氰酸荧光素,FITC、藻红 蛋白,PE) 与抗体连接成荧光抗体,再与 待测标本的抗原反应,置荧光显微镜下观 察,抗原抗体复合物散发出荧光,对标本 中抗原的鉴定和定位。
包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。
直接荧光法:将荧光素直接标记抗体作 标本染色。优点:是特异性强。缺点: 每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗 体。
第一节
抗原或抗体的检测
免疫标记技术包括:
免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素 标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体 金技术等。
抗原-抗体反应的特点:P226
抗原-抗体的特异性结合。 抗原抗体分子表面的非共价键结合。 反应的两个阶段:
特异性结合阶段;
可见的反应阶段。 是否呈现可见的反应现象,与抗原和抗体 两者的分子浓度和比例密切相关。
间接荧光法:用一抗与标本中的抗原结 合,再用荧光素标记的二抗染色。优点: 敏感性比直接法高,制备一种荧光素标 记的二抗可用于多种抗原的检测。
补体结合免疫荧光法:在间接法的第一 步抗原-抗体反应时加入补体,使之与抗 原-抗体复合物结合;再用荧光素标记的 抗C3抗体进行示踪。
间 接 免 疫 荧 光 法 示 意 图
放射免疫测定法 (Radioimmunoassay, RIA)
用放射性核素标记抗原进行的免疫学检 测技术。放射性核素显示的高灵敏性, 使检测的敏感性达pg水平。 常用于标记的放射性核素有I125和I131。
ห้องสมุดไป่ตู้
常用于胰岛素、生长激素、药物等微量 物质的测定。
免 疫 荧 光 显 微 技 术
流式细胞术
(Flow Cytometry, FCM)
FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪, 对单个细胞的表面标志(抗原或受体)进行 快速、精确的分析和自动检测,并将不同类 型的细胞分选收集。
FCM还可对同一细胞的多种参数(如DNA、 RNA、蛋白质和细胞体积等)进行多信息分析。
单向免疫扩散 (Single Immunodiffusion)
将一定量已知抗体混于 琼脂凝胶中制琼脂板; 打孔,将抗原加入孔中 扩散。 抗原与抗体相遇,形成 沉淀环,环的直径与抗 原含量成正比。
含抗体的凝胶
沉淀环
常用于测定血清IgG、 IgM、IgA 和 C 3等的含 量。
双向免疫扩散 (Double Immunodiffusion)
将抗原与抗体分别加入 琼脂凝胶的小孔中,二 者自由扩散并相遇,在 比例合适处形成沉淀线。
含两种以上的抗原抗体 系统,可出现两条以上 的沉淀线。 常用于抗原或抗体的定 性 、组成和两种抗原相 关性分析的检测。
免疫电泳 (Immunoelectrophoresis)
将待测血清标本作琼脂 凝胶电泳,不同分子量 蛋白组分开,然后与电 泳方向平行挖一小槽, 加入相应的抗血清,与 不同区带的蛋白抗原作 双向免疫扩散,在各区 带相应的位置形成沉淀 弧。 常用于血清蛋白种类分 析。
提
要
免疫学检测技术主要应用: 对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、 发病机制探讨; 对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、 粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。
第一节
抗原或抗体的检测
抗原-抗体反应包括:
沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体 结合反应、中和反应等。
抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测 未知的抗原;也可用已知的抗原检测未知的 抗体。
火箭电泳示意图
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标 记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应。 能极大地提高了反应的灵敏度,可以对 微量物质进行定量、定性或定位检测。 三种基本类型:免疫荧光技术、免疫酶 技术和同位素标记技术。
免疫荧光显微技术 (Immunofluorescence Technique)
酶联免疫吸附试验 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)
是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 (聚苯乙烯微量反应板)表面,使抗原 抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将 液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹 心法、间接法等。
ELISA
检测抗体
双抗体夹心法: 检测抗原