实验五.大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定

院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠

大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定

1 实验目的

学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。

2 实验材料与方法

2.1实验动物

大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周龄，150g左右

2.2试剂

1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮

Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml

2.3器材

低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等

2.4 实验操作

2.4.1试剂的配制

（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml

（2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。

2.4.2肝S9的制备

（1）诱导苯巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。

（2）采样采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。

（3）肝匀浆的制备弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液

3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。

（4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。

（5）分装保存将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。于液氮速冻后置-80℃低温保存。深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。

2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法）

2.5.1测定原理

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料在595nm 下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。

2.5.2特点

（1）灵敏度高，比Lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达0.5 μg （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。

2.5.3试剂与器材

试剂：

标准蛋白质溶液：1mg/ml 牛血清清蛋白（BSA ）

考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。

Tris-HCl 缓冲液： 6.05g Tris 加约80ml 蒸馏水溶解，用HCl 溶液调pH 值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml （0.05M ）

2.5.4操作方法

微量法制定标准曲线

按下表加样，混匀，室温静置5-10min ，以0号试管为空白对照，于595nm 处比色测定吸光度，平行测定三次。95nm 处吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

表一：测定标准曲线的试样

肝S9蛋白质浓度的测定

测定方法同上，分别取肝S9组分10倍稀释液20μL 、30μL 、40μL ，按下表加样，测595nm 的吸光度值，平行测定三次。根据所测定的平均值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。

样品编号

0 1 2 3 4 5 6 标准血清溶液（ug ） 标准血清溶液（ml ）

蒸馏水（ml ） 0 0 0.1 10 0.01 0.09 20 0.02 0.08

40 0.04 0.06 60 0.06 0.04 80 0.08 0.02 90 0.1 0

考马斯亮兰试剂（ml ）

5.0

表二：待测蛋白的试样

3 实验结果

表三：准曲线管的吸光度值

试样 1 2 3 4 5 6 一 0.012 0.087 0.209 0.330 0.465 0.630 二 0.062 0.084 0.245 0.360 0.472 0.600 三 0.085 0.100 0.258 0.380 0.445 0.620 平均值

0.053

0.090 0.237 0.357 0.461 0.617

图一：蛋白质浓度和吸光度的标准曲线图

表四： 稀释液样品吸光度值

试样 1 2 3 一 0.255 0.439 0.520 二 0.208 0.280 0.466 三 0.195 0.435 0.690 平均值

0.220

0.385 0.559

利用软件读出稀释液样品的蛋白分别为0.038、0.066、0.095。

算出三次取样的上清液浓度分别为19 mg/ml 、22 mg/ml 、24 mg/ml ，取平均值得蛋白质的浓度为21.7 mg/ml 。

样品编号 0 1 2

3 上清液（ml ） 蒸馏水（ml ） 0 0.1 0.02 0.08 0.03 0.07 0.0

4 0.06

考马斯亮兰试剂（ml ） 5.0