实验五.大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
新药药理毒理研究、分类及申报要求
主要内容
新药研究概述 新药的药理研究 新药的安全性评价 新药注册分类及申报资料要求 GLP简介
一、新药研究概述
➢ 新药定义：
新药（New Drugs）是指化学结构、药品组分和药理作用不同于 现有药品的药物。根据《药品管理法》以及2007年10月1日开始执行 的新《药品注册管理办法》，新药系指未在中国境内上市销售的药 品。对已上市药品改变剂型、改变给药途径、增加新适应症的药品， 亦属于新药范畴。
（2）以整体动物为好，“至少有一种整体动物模型”。
（3）离体器官可以作为药效学评选模型，试管内也可评选药物的药理作用， 但其基本反应性质必须是和整体情况下一致的。
（4）注意整体动物模型和各种体外模型的药理反应之间的差别。 如磺胺药体外作用极弱，而体内有效。对病毒体外筛选有效药很多，但体 内无效。抗肿瘤药物也是
2.动物选择
常用大鼠、Beagle犬、猴；也用小鼠、小型猪、新西兰兔
3.剂量组别设计
一般为四组，供试品设高、中、低三个剂量组，外加溶剂对照组；复方制剂设单方 对照组，手性药物设消旋体对照、改剂型或改给药途径药物设原制剂对照。高剂量要出 现明显的毒性反应，低剂量最低等同于药效学起效剂量，必须是安全剂量，剂距可以 根据药物情况灵活设计，一般为2-5倍。也可以不等比例。
急性毒性是指 药物在单次或24小时 内多次给予后一定时 间内所产生的毒性反 应。初步阐明药物的 毒性作用。对重复给 药毒性试验的剂量设 计和某些药物临床试 验起始剂量的选择具 有重要参考价值，并 能提供一些与人类药 物过量所致急性中毒 相关的信息。
急性毒性试验方法
经
最
限
近
金
上
累
典 急 性 毒 性 试
肝脏蛋白的提取和浓度测定
1.肝脏组织的提取
组织取材
操作 步骤
超声匀浆 冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次
考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种 结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰 在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大 吸收峰改变为595nm。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。
肝脏蛋白的提取 和浓度测定
医学基础实验室
了解并掌握 蛋白质的提 取方法
了解掌握考
马斯亮蓝法 （Braford法） 测定蛋白质
含量的原理 和方法
实验目的
实验内容
◆肝脏组织蛋白 的提取
◆蛋白的浓度测 定
1.肝脏组织的提取
原理：
RIPA裂解液是一种传统的细胞组 织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠 （sodium deoxycholate）, 0.1% SDS， 得到的蛋白样品可以用于常规的 Western。
动物肝脏的提取实验报告
动物肝脏的提取实验报告一、实验目的本次实验旨在通过一系列操作流程，从动物肝脏中提取有效成分，并对提取过程和结果进行详细记录和分析。
二、实验材料与设备1、实验动物：新鲜的猪肝（来自健康的成年猪）2、实验试剂：生理盐水、乙醇、丙酮、氯仿、蛋白酶抑制剂、磷酸盐缓冲液（PBS）等。
3、实验设备：离心机、匀浆机、电子天平、移液器、恒温水浴锅、真空冷冻干燥机、分光光度计、显微镜等。
三、实验步骤1、肝脏获取与预处理从市场购买新鲜的猪肝，确保其来源健康且无病变。
将猪肝用生理盐水冲洗干净，去除表面的血迹和杂质。
用剪刀将猪肝剪成小块，放入预冷的匀浆器中。
2、组织匀浆在匀浆器中加入适量的生理盐水，以1:3（组织质量:生理盐水体积）的比例进行匀浆。
启动匀浆机，将猪肝充分匀浆至细腻均匀的状态。
3、离心分离将匀浆液转移至离心管中，在 4℃下，以 3000 rpm 的转速离心 15分钟。
离心后，分为三层，上层为脂肪和杂质，中层为上清液，下层为沉淀。
小心吸取上清液，转移至新的离心管中。
4、蛋白提取在上清液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白质降解。
缓慢加入适量的乙醇，使乙醇终浓度达到70%，搅拌均匀后，在 4℃下静置 2 小时，使蛋白质沉淀。
5、再次离心将上述混合液在 4℃下，以 5000 rpm 的转速离心 20 分钟。
离心后，弃去上清液，收集沉淀。
6、溶解与透析将沉淀用适量的 PBS 溶液溶解，搅拌均匀。
将溶解后的溶液装入透析袋中，在 4℃下，用 PBS 溶液进行透析，每 4 小时更换一次透析液，透析 24 小时，以去除小分子杂质。
7、浓缩与干燥将透析后的溶液进行真空浓缩，至体积减少至原来的 1/5 左右。
将浓缩液放入真空冷冻干燥机中，干燥至粉末状，得到肝脏蛋白提取物。
四、实验结果与分析1、蛋白含量测定采用 Bradford 法测定提取的蛋白含量，结果显示蛋白浓度为____mg/ml。
与预期的蛋白含量相比，本次提取的蛋白产量略低，可能是在匀浆或离心过程中有所损失。
两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较
两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较王亚其;李宏霞;肖凯;刘玉清;刘斌;兰明【期刊名称】《现代预防医学》【年(卷),期】2006(33)4【摘要】目的:通过比较联合诱导法和多氯联苯诱导法制备的S9的活化作用,探讨两种S9活化作用的差异对两种试验阳性结果的影响。
方法:采用Ames试验方法和染色体畸变试验方法对两种S9活化的阳性结果进行比较。
Lowry法测定两种S9的蛋白含量,Omura法测定P450含量。
结果:Ames试验和染色体畸变试验中两种S9在阳性组中都显示出明显活化作用,同一条件下,Ames试验中使用两种S9所得阳性结果并无较大差异,染色体畸变试验中两种S9活化的阳性组畸变率间差异无统计学意义(P>0·05)。
多氯联苯诱导法S9的蛋白含量13·25g·L-1,P450含量为3·92nmol·mg-1蛋白,联合诱导法S9蛋白含量为15·25g·L-1,蛋白含量P450含量为2·94nmol·mg-1蛋白。
结论:两种S9在Ames试验和染色体畸变试验中对相应阳性诱变剂都有明显的活化作用。
可以认为两种S9在Ames试验和染色体畸变试验中对于相应的阳性化学物活化作用无较大差异,联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备肝匀浆S9。
【总页数】4页(P457-459)【关键词】联合诱导法;多氯联苯诱导法;肝S9;Ames试验;染色体畸变试验;Lowry 法;Omura法【作者】王亚其;李宏霞;肖凯;刘玉清;刘斌;兰明【作者单位】四川大学华西医学中心公共卫生学院;国家成都中药安全性评价中心【正文语种】中文【中图分类】R99【相关文献】1.不同诱导方法制备大鼠肝微粒体酶及其活性的比较 [J], 高梅;曹冲;英永;马会;贾庆文2.联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定 [J], 余大为;侯言东(通讯作者)3.螺旋涂布法评价联合诱导制备大鼠肝 S9的活性大小 [J], 单纯;张凤兰;崔生辉4.自拟通络祛浊方对两种不同方法诱导大鼠非酒精性单纯性脂肪肝模型的干预效果及机制研究 [J], 金毅;吕爱贞;黄宝明;邢伟;郑又铭;张金龙;杨雯;徐愉林;李静5.在鼠伤寒沙门氏菌致突变试验中比较人肝细胞和人肝S9与大鼠肝制剂活化系统对激活诱变剂的影响 [J], 王国钦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定
S9代谢活化酶系统制备及蛋白含量的测定何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【摘要】目的:研究有效的S9代谢活化酶系统的制备方法. 方法:采用苯巴比妥钠作为诱导剂制备大鼠肝S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9蛋白含量. 结果:成功制得大鼠肝S9, 并测定其蛋白含量为38.66mg/ml. 结论:苯巴比妥钠作为诱导剂可以成功制备出大鼠肝S9.【期刊名称】《西南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(036)002【总页数】3页(P243-245)【关键词】S9制备;蛋白含量测定【作者】何黎黎;杨立开;邓黎;龚涛;孙迅;张志荣【作者单位】西南民族大学化学与环境保护工程学院,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041;四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室,四川成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R9许多致癌剂的生物转化是依赖细胞内微粒体混合功能氧化酶系来完成的. 大鼠肝S9(Hepatic post-mitochondrial supernatant)是许多体外实验常用的体外活化系统, 其主要有效成分为混合功能氧化酶(mixed function oxidase , MPO) 系统, 其中许多酶共同组成电子传递体系, 其中细胞色素P450(CYP450)在整个酶系中起着末端氧化酶作用, 具有活化氧分子和与底物结合的双重功能. CYP450在氧化活动和底物结合中的作用决定其在MPO系统中起决定作用[1], 苯巴比妥钠是目前大鼠肝S9常用的诱导剂[2,3], 能诱导活化许多致癌性化学物所需要的细胞色素. 因此, 本文采用苯巴比妥钠作为诱导剂, 制备S9, 并采用Lowry法测定所制备的S9的蛋白含量,进而研究有效的S9代谢活化酶系统制备方法和测定方法.1.1 药品与试剂KCl(分析纯), 苯巴比妥钠(分析纯), MgCl2 6 H2O(分析纯)PBS缓冲液(自配), 6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate, Sigma, 美国), 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶Ⅱ, nicotinamide -adenine dinucleotide phosphate, NADP, Sigma, 美国), Lowry法蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)1.2 仪器冷冻高速离心机(Beckman, AllegraTMX-22R, 美国)；紫外可见分光光度计() 1.3 实验动物Sprague –Dawley大鼠, 雄性, 体重约200g/只(四川大学华西动物实验中心)2.1 肝酶系统的诱导用苯巴比妥钠诱导制备大鼠肝脏S9[2,4]. 将苯巴比妥钠用生理盐水配置成10mg/ml的溶液. 选用体重约200克的Sprague –Dawley雄性大鼠腹腔注射苯巴比妥钠溶液80mg/kg(每日一次), 连续给药三日. 于第四日断颈处死.2.2 大鼠肝S9的制备取采用苯巴比妥钠诱导大鼠, 处死后立即无菌条件下冲洗并取出肝脏. 立即用4℃含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗肝脏. 再按3 ml/g 湿重的比例加入含有1.15% of KCl 的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)于冰浴中匀浆. 合并匀浆, 并于冷冻高速离心机中9000×g离心30min, 取其上清液即为S9. 蛋白质含量按 Lowry 法测定. 测定合格者, 用离心管分装为1.0ml/管, -80℃冰箱中保存, 在实验使用前将冷冻的S9 缓慢融化. 将1 ml S9, 0.33 ml 1 M KCl, 0.32 ml 0.25 M MgCl2 6 H2O, 0.25 ml 0.2 M 6-磷酸葡萄糖, 1 ml 0.04 M NADP, 2.10 ml去离子水和5 ml 磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)配制成代谢酶活化系统[5,6].2.3 Lowry法测定S9中蛋白含量2.3.1 标准曲线的绘制取6个带盖的1.5 ml离心管, 编好号后, 按下表顺序加入试剂：每管加入碱性铜试剂工作液后需立即混匀, 20～25℃放置10min后加入Folin-酚试剂, 混匀后, 20～25℃放置30min后在660nm下比色测定(1ml比色杯, 1cm光径测定). 以蛋白含量(μg/μl)为横坐标, 吸光值为纵坐标, 绘出标准曲线；2.3.2 自制S9样品的蛋白浓度测定分别取3份分装后的大鼠肝S9样品, 生理盐水稀释100倍, 取样品稀释液总体积为200μl, 加入碱性铜试剂工作液1000μl, 充分混匀, 置20～25℃水浴保温10分钟后, 加入1N Folin-酚试剂100μl, 20～250C放置30min后, 以标准曲线0号管做参比, 在660nm波长下比色, 记录吸光值. 根据所测样品的吸光值, 在标准曲线上即可查得相应的蛋白质含量(μg/μl), 乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度.3.1 Lowry法测定蛋白含量的标准曲线按照lowry法, 采用蛋白质标准工作液进行测定, 将蛋白含量对紫外可见吸收值(OD)作图, 得到标准曲线, OD=0.7662×C+0.0086, R2=0.9928, 线性关系良好, 线性范围为：0.1mg/ml-0.5mg/ml.3.2 自制大鼠肝S9蛋白质含量的测定根据3份自制大鼠肝S9稀释液测得的平均吸光度(OD值), 带入蛋白含量测定标准曲线, 即可求得平均蛋白含量. 测得所制备的大鼠肝S9平均蛋白含量为38.66mg/ml.在制备S9混悬液过程中, 应注意用新鲜冰冷的0.15 mol/l氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次,以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白. 所制备得到的S9应测定蛋白浓度[1,2], 本实验应用Lowry法测定大鼠肝S9 蛋白浓度, 其显色原理为Folin酚试剂与蛋白质的酷氨酸和色氨酸残基反应显蓝色, 可采用紫外分光光度法测定吸收值测定.【相关文献】[1] 王亚其, 李宏霞, 肖凯, 等. 两种诱导方法制备大鼠肝S9在两种遗传毒性试验中活性比较[J]. 现代预防医学, 2006, 33(4):457-459.[2] FABIANI R, ROSIGNOLI P, BARTOLOMEO AD, et al. DNA-damaging ability of isoprene and isoprene mono-epoxide (EPOX I) in human cells evaluated with the comet assay[J]. Mutat Res, 2007, 629: 7-13.[3] 程培英, 曲桂娟, 马红霞, 董晓庆. 苷肽注射液对鼠致突变作用的研究[J]. 吉林农业大学学报, 2007, 29 (3) :334-337.[4] AARON CS, BOLCSFOLDI G, GLATT HR, et al. Mammalian cell gene mutation assays working group report[J]. Mutat Res, 1994, 312: 235-239.[5] EREXSON GL, PERIAGO MV, SPICER C S. Differential sensitivity of Chinese hamster V79 and Chinese hamster ovary (CHO) cells in the in vitro micronucleus screening assay[J]. Mutation Research, 2001, 495: 75-80.[6] EKE D, CELIK A. Genotoxicity of thimerosal in cultured human lymphocytes with and without metabolic activation sister chromatid exchange analysis proliferation index and mitotic index[J]. Toxicology in vitro, 2008, 22: 927-934.。
最新[医学]Western blot法检测大鼠肝组织清蛋白的表达实验-药学医学精品资料
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蛋白含量的测定及上样量的计算 考马斯亮蓝法（Bradford法）
H+
考马斯亮蓝G-250 + 蛋白质
蓝色
595nm
14
操作：
蒸馏水(ml)
空白管 标准管 测定管 0.05
标准蛋白液(ml)
0.05
样品(ml)
(适当稀释)
显色剂(ml)
(5倍稀释)
0.05 3.0 3.0 3.0
混匀，静置10min，于595nm处，以空白管 调零，测定各管吸光度
25
凝胶成分：
丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺 3M Tris缓冲液(pH=8.8) 2M Tris缓冲液(pH=6.8) N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 10%过硫酸铵(APS) 10%SDS ddH2O
26
装置：
27
SDS-PAGE电泳操作：
① 安装制胶装置，检查是否漏水 ② 配制10％分离胶（灌胶约2/3体积），蒸馏水液封 ③ 胶凝后倾去蒸馏水 ④ 配制4％堆积胶，灌满，插入梳子 ⑤ 胶凝后拔出梳子
40
▪ DAB显色操作：
按试剂盒说明配制显色剂
（按照1ml双蒸水中滴加A、B、C液各一滴的比例）
将NC膜置于配制好的显色液中
室温条件下显色约15分钟
（视显色的情况而定）
蒸馏水洗膜，并可进行结果的分析 41
结果分析
根据结合于膜上的预染Marker确定目的条带 可根据条带光密度扫描积分值进行定量分析 42
PP间期：并不绝对匀齐，但PP间期的互差<0.12 秒。
心房频率：60～100次/分。小儿不超过正常相应 年龄组心率95％或不低于正常相应年龄组的5％。
窦性心动过缓诊断要点
westernblot法检测大鼠肝组织血清蛋白的表达变化
westernblot法检测⼤⿏肝组织⾎清蛋⽩的表达变化Western-blot⼀、实验⽬的1、⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析2、⽬的蛋⽩与其他蛋⽩的相互作⽤⼆、实验原理在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测的⼀项技术。
与Southern Blot或Northern Blot杂交⽅法类似，但Western Blot法采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
Western Blot显⾊的⽅法主要有以下⼏种：i. 放射⾃显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈⾊现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊，体同⽔平和实验条件的是⽤第⼀种⽅法，发表⽂章通常是⽤底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就⾏，操作也⽐较简单，原理如下（⼆抗⽤HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁⽶诺，如遇到HRP，即发光，可使胶⽚曝光，就可洗出条带。
三、实验器材及试剂1、器材：（1）可调移液器P1000、P200和P20，经消毒的相应的盒装吸头（2）经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及⽔浴锅⽤试管架（3）定时器，记号笔，⼀次性⼝罩和筒纸（4）于冷室中预冷的1.4万转台式离⼼机（5）PH试纸（6）分光光度仪，⽯英⽐⾊杯（7）烧杯，量筒，棕⾊试剂瓶（8）0.45um滤纸2、主要试剂(1)⼀抗：⼩⿏抗⼤⿏多克隆抗体（清蛋⽩，分⼦量66kD）(2)⼆抗：⽺抗⼩⿏IgG-HRP(3)定蛋⽩试剂盒：南京建成⽣物⼯程研究所。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突
鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验)文献综述
文献综述：鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。
美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；1 前言污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。
世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。
美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。
众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。
2 定义2.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
大鼠肝微粒体的制备
2.1。
3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物 SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180—220)g，广州中医药大学实验动物中心提供.合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠(30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后,打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色.3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0。
25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min.5．保留上清并转移到超速离心管中,在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液(含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min,得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7。
4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et。
al。
方法(Lowry et al.,1951），首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液,与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度,根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法（Omura andSato,1964）,用Tris—HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0。
3−0.5 mg/mL,取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池， 400 nm~500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描,记录450 nm和490 nm 处的吸光度,按Beer 定律（公式2。
肝细胞观察实验报告
一、实验目的通过本次实验，了解肝细胞的基本形态和结构，观察肝细胞的脂肪变性情况，分析肝细胞脂肪变性的原因及影响因素，为临床诊断和治疗提供参考。
二、实验材料1. 实验仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、酒精灯、镊子等。
2. 实验试剂：肝细胞组织样本、苏木精染色液、伊红染色液、盐酸酒精、蒸馏水等。
3. 实验动物：大鼠。
三、实验方法1. 样本制备：取大鼠肝脏组织，固定于10%甲醛溶液中，切片后进行苏木精-伊红染色。
2. 染色：将切片放入苏木精染色液中染色5-10分钟，流水冲洗；然后放入伊红染色液中染色1-2分钟，流水冲洗。
3. 观察：使用显微镜观察肝细胞的基本形态和结构，记录肝细胞的脂肪变性情况。
四、实验结果1. 肝细胞基本形态和结构：肝细胞呈多边形，大小不一，细胞核位于细胞中央，细胞质丰富，含有线粒体、内质网、高尔基体等细胞器。
2. 肝细胞脂肪变性情况：部分肝细胞内出现脂肪滴，呈黄色，分布不均。
部分肝细胞核固缩，细胞质减少，细胞膜皱缩，呈气球样变性。
五、实验分析1. 肝细胞脂肪变性的原因：肝细胞脂肪变性可能与以下因素有关：（1）营养因素：长期摄入高脂、高糖、高胆固醇等食物，导致脂质代谢紊乱，脂肪在肝细胞内积累。
（2）酒精因素：长期饮酒可导致肝细胞损伤，影响脂质代谢，引起脂肪变性。
（3）药物因素：某些药物如抗肿瘤药物、免疫抑制剂等可导致肝细胞脂肪变性。
（4）代谢性疾病：如糖尿病、肥胖等代谢性疾病可导致脂质代谢紊乱，引起肝细胞脂肪变性。
2. 肝细胞脂肪变性的影响因素：肝细胞脂肪变性受以下因素影响：（1）性别：女性肝细胞脂肪变性发生率高于男性。
（2）年龄：随着年龄增长，肝细胞脂肪变性发生率逐渐增加。
（3）肥胖：肥胖者肝细胞脂肪变性发生率较高。
（4）糖尿病：糖尿病患者肝细胞脂肪变性发生率较高。
六、实验结论通过本次实验，我们观察到肝细胞的基本形态和结构，并分析了肝细胞脂肪变性的原因及影响因素。
肝细胞脂肪变性是临床常见的病理现象，可能与多种因素有关。
Ames
点试法
掺入法
背景菌生长良好受试物 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入 每皿回变菌落数增加一 顶层培养基中，倒入底层培养基中， 倍以上并有剂量-反应 凝固后37℃培养48h观察结果 关系，试验结果具有重 现性即可认为该受试物 为诱变阳性。
毒理学基础实验课
七、溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂； 如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突 变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、
丙酮、95%乙醇。
一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按
每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定
加入量为100l。
滤纸片（有结晶紫） 抑菌环
0.1ml菌液
37℃24h
顶层
普通培养基
毒理学基础实验课
3、紫外线敏感特性
原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长， 而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。 鉴定方法：用灭菌牙签分别将菌株划线接种于普通培养基上，打开平皿盖，用 灭菌黑布盖住一半培养基，用15W紫外灯在距离33cm处照射8s，37℃温箱培养 18h~24h。 结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具 有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
诱导 －最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯 联苯（PCB混合物），
－选择健康雄性大鼠体重200g左右，
－一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。
诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。
三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的致突变实验
(2).脂多糖屏障缺陷的鉴定
• 加热融化营养肉汤琼脂培养基。接种：取菌液 0.1mL移入平皿，迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷 却至50℃左右)适量倒入平皿，混匀，平放凝固。 将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平皿中央， 用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液(鉴定菌 株用) 10μL，37℃培养24h，每个菌做一个平皿。 结果：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带， 说明存在rfa(深粗型)突变。这种变化允许某些大 分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、 TA98、TA100和TA102均有抑制带，野生型鼠伤寒 沙门氏菌没有抑制带。
三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌 的致突变试验
一、实验目的
1、掌握Ames试验的基本原理及应用 2、了解Ames试验的基本步骤 3、通过该实验，了解三氯乙烯的致突变作用
二、实验原理
• 原理：是一种利用微生物进行基因突变的体外 致突变试验方法。基本原理是利用同一种微生 物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若 此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物 再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这 种突变叫做回复突变。
变性。
1 材料与方法
• • 1.1 样品 复方生物黄酮的商品名称为圣安泰牌百力康
片，由哈尔滨圣安泰生物 科技 有限公司提供。样品以枸 杞、黄芪、银杏叶为主要原料，辅以其他辅料制成，功效 成分为总黄酮。 • • 1.2 材料 昆明种小白鼠（批准证号：医动字第09-2-7 号），购自黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心。TA97a、 TA98、TA100和TA102四种菌株引自美国加州大学Ames 实验室。 • •
1.3 方法
• TA97a、TA98、TA100和TA102 四种菌株引自美国加州大学Ames实验 室。经菌株特性鉴定均符合实验要求。活化系统为PCB-五氯诱导的雄性 Wistar大鼠肝s-9液。按1：9加入辅助因子（Ames 1983年配方）配成10 ％ s-9混合液，经阳性诱变剂活性鉴定符合实验要求。实验样品经XAD11树脂柱过滤及洗脱预处理，最后以DMSO为溶剂，剂量设计分别为5mg/ 皿、1mg/皿、0.2mg/皿、0.04mg/皿和0.008mg/皿受试物。除上述5个剂 量组外，又设未处理对照组、溶剂对照组（DMSO）和阳性对照组［加s9用2-AF（TA102用1，8-二羟蒽醌），不加s-9用DEXON（TA100用叠氮 钠）］。采用平板渗入法进行实验。在保温的顶层培养基中依次加入测试 菌株新鲜增菌液0.1ml，混匀；加受试物或对照物0.1ml［需活化时加入10 ％ s-9混合液0.5ml（含s-9 5μl）］，论文联盟整理再混匀，迅速倾入 底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化， 37℃培养48h观察结果。每个剂量平行做了3皿，并重复一次，最后以3皿 平均值报告实验结果.
实验五.大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠大鼠肝S9的制备和蛋白含量测定1 实验目的学会大鼠肝S9的制备及其蛋白含量的测定。
2 实验材料与方法2.1实验动物大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周龄，150g左右2.2试剂1.17% （0.15M） KCl、苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、多氯联苯、β-萘黄酮Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约800ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml2.3器材低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等2.4 实验操作2.4.1试剂的配制（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris加约80ml蒸馏水溶解，用HCl溶液调pH值至7.4，最后用蒸馏水定容至1000ml（2）考马斯亮兰G-250染料：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸馏水稀释至1升，滤纸过滤。
2.4.2肝S9的制备（1）诱导苯巴比妥钠80mg/kg，腹腔注射，连续3～5d，最后一次给药后24h后采样。
（2）采样采样前禁食24h，但可以自由饮水；断头处死；无菌取出肝脏，置平皿中称重，用预冷的0.15M KCl溶液淋洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。
（3）肝匀浆的制备弃去淋洗液，将肝脏转入小烧杯，加 Tris-HCl缓冲液溶液3mL/g （肝湿重），转入冰浴，用剪刀剪碎肝脏，转入匀浆器匀浆。
（4）制备S9 将肝匀浆于低温高速离心机0～4℃ 000g 离心 10min上清液即为S9。
（5）分装保存将制备好的S9于无菌冷冻管或安瓿中保存，每个安瓿2mL左右。
于液氮速冻后置-80℃低温保存。
深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
2.5蛋白含量测定（考马斯亮兰染色法）2.5.1测定原理考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质（主要是碱性氨基酸，特别是精氨酸和芳香族氨基酸残基）结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm 变为595nm ，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定
联合诱导法制备大鼠肝S9及蛋白含量的测定摘要】目的测定联合诱导法和多氯联苯诱导法制备的大鼠肝S9的蛋白含量并对这两种方法进行比较。
方法采用苯巴比妥与β—萘黄酮合并诱导所获S9作为诱导剂制备大鼠肝S9,并采用Bradford法测定所制备的S9蛋白含量。
结果成功制得大鼠肝S9,并测定其蛋白含量为26.73 mg/ml。
结论联合诱导法可以替代多氯联苯诱导法制备肝匀浆S9。
【关键词】联合诱导法 S9制备蛋白含量测定Preparation of rat liver S9 by combination inducing method and determination of protein in the prepared S9Yu Dawei, Houyandong*,(Gansu Provincial Center for Disease Control ＆ Prevention, Lanzhou 730000)【ABSTRACT】 Objective: To determine the content of protein in rat liver S9 prepared by combination inducing method and PCB inducing method and compare the two methods. Methods: Rat liver S9 was prepared using S9 obtained by combination inducing method with phenobarbital and β-naphthoflavone as the inducer and the content of protein in the prepared S9 was determined by Bradford method. Results: Rat liver S9 was successfully prepared and the protein content was 26.73 mg/ml. Conclusion: Combination inducing method may supersede PCB inducing method for preparation of liver homogenate S9.【Key words】 combination inducing method S9 preparation protein determination 多氯联苯(Polychlorinated biphenyls , PCBs)是一种极其稳定的致癌剂，目前环境中所存在的10亿多磅多氯联苯已引起人们的关注。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。