致病性弧菌增菌培养基和选择性鉴别培养基的研究

密级:公开中图分类号 :TS207.4
④声浮二商砍事
硕士学位论文
论文题目:
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学科专业:
研究方向:
指导教师:
提交日期:二。一0年一月 DissertationSubmittedtoZhejiangGongshang
UniversityforMaster， 5DegreeofEngineering
studesonEnrichmentMediumandSeleetiveDil…ferential
MediumofPathogenie巧brio
Author:KeminShen
Major:FoodScience
SuPervisor:Prof.GuangyingZhao
Jan.2010
CollegeofFoodSeieneeandBiotechnology
Engineering， ZhejiangGongshangUniversity
Hangzhou，310035，P.R.China浙江工商大学硕士学位论文
致病性弧菌增菌培养基和选择性鉴别培养基的研究
摘要
致病性弧菌(pathogenic巧brio)属于弧菌属(genus巧brio)，有12个种，包
括霍乱弧菌(巧 brioeholerae)、副溶血性弧菌(巧brio那rahaemolyric。)、创伤弧
菌(巧 briovuln沪eus)、海鱼弧菌(巧 briodamsela)、拟态弧菌(巧 briomi，ieus)、辛
辛那提弧菌(巧brioc万nc万nnariensis)、梅氏弧菌 (Vibriometschnikovi万)、霍利斯弧
菌(巧 brioholl才sae)、河流弧菌(Vibrioj7uvialis)、弗尼斯弧菌(巧briofurnissii)、溶
藻弧菌(巧brioa勿n口lylicus)和鳖鱼弧菌(巧bri口carchariae)。致病性弧菌是影响
水产品安全的重要因素，通常存在于近海海水、海底沉积物、浮游生物、海
产品(鱼类和贝类)中，是夏秋季沿海地区引发食物中毒的首要病原菌。人类多
因食入未煮熟的海产品或污染此菌的盐渍食物而感染;主要症状为腹痛、腹
泻、呕吐和发热等。如果不及时治疗，可能会危急生命。
选择性鉴别培养基是在生化反应的基础上开发的技术，它将传统的细菌
分离与生化反应有机的结合起来，使得检测结果直观，易于观察辨别，且具
有低成本、特异性强、灵敏度高和检测快速、操作方便等优点。选择性鉴别
培养基是国内外微生物检测发展的一个主要发展方向。目前，致病性弧菌仅
有副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌具有选择性鉴别培养基，其它致病性
弧菌尚没有。本研究的目的和意义是设计和研制其它致病性弧菌的选择性鉴
别培养基，以满足和储备日益严格的食品安全标准和不同检测条件的需求。浙江工商大学硕士学位论文
本论文主要围绕以下几个方面开展了一些工作:
1致病性弧菌增菌培养基及培养条件的改进研究
本试验对弧菌增菌培养基(VEM)及培养条件进行改进研究，经过优化，获
得一套适用于致病性弧菌增菌的VEM及培养条件。试验结果表明:以副溶血
性弧菌为代表，用vEM在(36士l)“c+摇床 120r/min+2层牛皮纸封口条件下
增菌培养，在相同时间内，其增菌菌液浓度是GB厅4789.7一2008中规定方法的
碱性蛋白炼水(APw)增菌菌液浓度的 1.8士0.6倍;对12中致病性弧菌进行的
增菌培养试验结果表

明，VEM能有效促进12种致病性弧菌的生长繁殖。VEM
组成为:混合蛋白陈2%(胰蛋白陈:鱼蛋白陈为1:3)、酵母浸膏0.2%、Nacl3%、
pHS.6。这为后续工作的顺利开展奠定了基础。
2创伤弧菌选择性鉴别培养基的研制
本试验以创伤弧菌特有的酶系统及其代谢特点和对某些特定抑菌成分的
抵抗力为基础，设计研制了创伤弧菌选择性鉴别培养基(vvDM)。试验中对
VvDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:VvDM
对创伤弧菌具有较好的选择性和特异性;用vvDM在 39OC培养 16h佗4h，
创伤弧菌菌落为黄色;其它各种弧菌及非弧菌属致病菌菌落呈绿色或未形成
有效的可见菌落;vvDM对创伤弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为 (92.42士
3.43)%;检出限为10’c创mL;因此，vvDM对海产品中创伤弧菌分离鉴别与
检测是可行的，且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。
3拟态弧菌选择性鉴别培养基的研究
本试验以拟态弧菌特有的酶系统及其代谢特点和对某些特定抑菌成分的
抵抗力为基础，设计研制了拟态弧菌选择性鉴别培养基 (VInDM)。试验中对浙江工商大学硕士学位论文
VlnDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:37℃
培养24h时，VlnDM对拟态弧菌具有较好的选择性和特异性;拟态弧菌菌落
为绿色或蓝绿色，其它弧菌菌落呈黄色或没有有效菌落形成;VmDM对拟态
弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为(90.1士6.8)%;检出限为IOZc创mL。因此，
VI五DM对海产品中拟态弧菌分离鉴别与检测是可行的，且具有操作简便、经
济、结果易于观察等优点。
4辛辛那提弧菌选择性鉴别培养基的研制
本试验基于辛辛那提弧菌特有的综合酶系统及其代谢特点和对某些抑菌
剂的抵抗力，设计开发出辛辛那提弧菌选择性鉴别培养基(VciDM)。试验中对
VciDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:37oc
培养16h一24h，vciDM对辛辛那提弧菌具有较好的选择性和特异性;辛辛那
提弧菌菌落为黄色，其它致病菌菌落呈绿色或没有有效菌落形成;VoiDM对
辛辛那提弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为(82.14士4.45)%;检出限为101
cfu/mL。因此，VciDM对海产品中辛辛那提弧菌分离鉴别与检测是可行的，
且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。
5海鱼弧菌的选择性鉴别培养基的研制
本试验以海鱼弧菌特有的综合酶系统及其代谢特点和对某些抑菌剂的抵
抗力为基础，设计开发出海鱼弧菌选择性鉴别培养基(vdDM)。试验中对
VdDM的显色效果、平板效率、灵敏度和特异性进行评价。结果显示:37oC
培养16h一24h，vdDM对海鱼弧菌具有较好的显色效果、平板效率、选择性
和特异性

;海鱼弧菌菌落为绿色:其它致病菌菌落呈黄色或未形成有效的可
见菌落;VdDM对海鱼弧菌的出菌效率与嗜盐琼脂相比为 (83.46士3.42)%;检浙江工商大学硕士学位论文
出限为10，c创mL。因此，vdDM对海产品中海鱼弧菌分离鉴别与检测是可行
的，且具有操作简便、经济、结果易于观察等优点。
VEM分别与四种选择性鉴别培养基结合检测目标致病性弧菌的方法与常
规方法(TCBs结合法国梅里埃细菌鉴定系统 API20E试剂条或弧菌科生化鉴
定管)相比，结果直观，易于观察，减少了溶藻弧菌等常伴菌的干扰，省去了
TCBS分离培养后的生化试验，降低检测成本，减少工作量，操作简便，具有
更高的检测效率和鉴别能力。
关键词:选择性鉴别培养基;致病性弧菌;快速检测;创伤弧菌;拟态弧菌;
辛辛那提弧菌;海鱼弧菌浙江工商大学硕士学位论文
STUDESONENRICHMENTMEDIUMANDSELECTIVE
DIFFERENTIALMEDIUMOFPATHOGENIC
ABSTRACT
Pathogenie巧 briobelongingtogenus巧brio， whiehhas12sPeeies，ineluding
巧 briocholerae，巧 brioParahaemolyticus，巧 briovuln沪cus，巧 briodan，sela，巧brio
mimzc璐，巧 briocincinnatiensjs，环 briometschniko飞，11，巧 brjoholljsae，巧brio
j7uvialfs，巧br才 0furnissj万，巧br才oa匆nolyr万 cusand巧br泛 0earchariae.Pathogenie
片 brjo15oneoftheimPortantfactorsinfluencingAquaticsafety.AsatyPeof
haloPhiliebaeteria， itusuallyexjstsinoffingseawater， seabedsediment，Plankton，
andseafood(fishandseashell).Pathogenie巧br才 015thePrimaryPathogenthat
causesfoodPoisoninginlittoralduringsulll刀 lerandautulnn.PeoPlecouldbe
infectedmostlybecauseofuncookedseafoodorPickledfoodwhichare
contan卫 natedbyPathogenic片b八 0.ThePrimarysylnPtomsarebellyaehe，diarrhea，
vo而t， feverand50on.LifewillbeindangerifthePatientcouldn’ tbetreatedin
tilne.
SeleetiveDifferential一nedia， whieh15basedonbiochemicalreaetion，isa
detectionteehnology.Ithassuceessfullyeombinedthereactionofbioehe而stry
V浙江工商大学硕士学位论文
andtheti· aditionalseParationofbiochemistryofbacterium， whieh15easyto
observetheresultofdeteetion.Inaddition， therearesorneadvantages一 loweost，
highsensitivity， sPecifieityandraPidness.SeleetiveDifferentialmedia15beeo而ng
themaintrendof而 crobialdetection.AtPresent，only巧 brjoParahae脚olyticus，
Vibriocholeraeand巧 briovuln沪 cushasaselectivedifferentialmediuln.butother
Pathogenie巧 brionotyet.ThePurposeofthisstudy15todesignSeleetive
Di月七 rentialMediumfortherapidseParatio几 identificationanddeteetionofother
Pathogenic巧brio， tomeettheneedsoftheinereasinglystringentfoodsafety
standardsanddifl七 renttesteonditions.
TheresearchescarriedoutinthisPaperwouldbedescribedasfoll

ows:
1.Studyonenriehmentmediumandeul加 reconditionsofPathogenie阵brio
Thisl· esearchoPt而让ed巧brioe而 chmentmediumandcultureconditionsin
ordertoobtainamethodforenriehingvibrio， Theresultsshowedasfollow， taking
巧 brzoParahaemolytieusforexamPle， theextractofthemyceliawhichhadbeen
cultUredon巧 brloeultureInediumsealedbyDouble一 LayerKxaftPaPerinshake
condition(36土l)。C， 120r/min15(1.8士 0.6)timesthanthatofthemyeeliaeultured
onAPW(GB/T4789.7一 2008)underthesamecondition.Theresultof12
Pathogenie巧 brjoenriehmenttestshowedthat，巧brioe而 chmentmediumean
effeetivelystimulatethegrowthandreProductionof12PathogenicVibr才0.娇brio
em-ichmentmediu一 n15eomPosedof仰 Ptone0.5%， fishPePtone1.5%，yeast
extl· aet0.2%，NaC13%， PH8.6.F叭 herexPerimentcouldbesuccessfullyc田Tied
onwiththesuPPortoftheabovework.
2.studyonVibrio vulni6cusDi亩 TcrentialMediunl
V1浙江工商大学硕士学位论文
BasedonthesPeeifieenZymesystemsandthecorresPondingmetabolismsof
巧 briovuln沪cus， accordingtotheresistibilitytodifferentantibacterialingredients，
VvDMwasdesignedfortheraPidseParatio几 identifieationordeteetionofVibrio
vuln沪 eus.Thetestsofcoloreffects， Platingefficiency， sensitivityandsPecificity
wereeonductedtoevaluatetheefficiencyofVvDM.Theresultsshowedthat:
VvDMhadgoodselectivityandsPeeifieityfor巧 briovuln功 cus.Afterineubating
for16一 24hat39“C，the巧 briovuln沪 cusformedyelloweoloniesonVvDM.The
otherstrainsdidnotformcoloniesorformgreeneolonies.VvDMshowedamean
Platingefficieneyof巧 briovuln沪 cuseellsof(92.42士 3.43)%anditsdeteetion11而t
was10’cfi刀mL，Accordingly， VoM15usefultodetect巧 briovuln功 cusforkinds
ofinsPectionageneieswiththestrengthensofeasily一operated， lowereost，
eonvenieneeforobservationand50on.
3.5加 dyonVibriomimieusDifferentialMedium
BasedonthesPeeificenZymesystemsandtheeorresPondingmetabolismsof
巧 brjomjmicus， aecordingtotheresistibilitytodifferentantibacterialingredients，
VI宜 DMwasdesignedfortherapidseParatio几 identifieationordetectionof片brio
mjmieus.Thetestsofeoloreffects， Platingefficieney， sensitivityandsPecifieity
wereeonductedtoevaluatetheefficiencyofVlnDM.Theresultsshowedthat:
VmDMhasgoodseleetivityandsPecifieityfor巧 brjomimicus.Afterineubating
for24hat37“C，the巧 briomimicusformedgreeneoloniesonVmDM.Theother
strainsdidnotformcoloniesorformedyellowcolonies.VlnDMshowedamean
Platingeffieieneyof片 briomimieuseellsof(89.80士 3.43)%anditsdeteetion11而t
was102cfi刀InL.Aeeordingl又vlllDM 15useful
Vll
forkindsofinsPeetionagenciesto浙江工商大学硕士学位论文
detect巧 briomimjcuswiththestrengthensofeasily一operated， lowereost，
convenienceforobserv

ationand50on.
4.StudyonVibrioeineinnatiensisDifferentialMedium
BasedonthesPecificenZymesysternsandthecorresPondingmetabolismsof
巧 briocincinnarie脚is， accordingtotheresistibilitytodifferentantibacterial
ingredients， VciDMwasdesignedfortherapidseParatio几 identificationor
detectionof巧 briocincinnatiensis.Thetestsofeoloreffects， Platingeffieieney，
sensitivityandsPecificityweredonetoevaluatetheefficiencyofVe泊M.The
resultsshowedthat:VeiDMhasgoodseleetivityandsPeeificityfor巧brio
cineinnaliensis.Afterineubationfor16一 24hat37OC，The片 briocincinnatiensis
formedyellowcoloniesonVeiDM.Theotherstrainsdidnotformcoloniesor
formedgreencolonies.VciDMshowedameanPlatingefficiencyof巧brio
c， ncinnariensiscellsof(82.14士4.45)0， 0anditsdeteetion一i而 twas10’c允/毗.
Accordingly， VciDM
cineinnaliens万 5with
15usefulforkindsofinsPeetionageneiestodetect巧brjo
thestrengthensofbeingeasily一oPerated， lowereost，
eonvenieneeforobservationand50on.
5.5加 dyonVibriodamselaDifferentialMedium
BasedonthesPeeificenzymesystemsandthecorresPondingmetabo!ismsof
竹brioda胡sela， accordingtotheresistibilitytodifferentantibaeterialingredients，
VdDMwasdesignedfortherapidseParation， identifieationordeteetionof片brio
danz、 elaThetestsofcolore价cts， Platingeffieiency， sensitivityandsPeeificity
wel一 edonetoevaluatetheefficieneyofVdDM.Theresultsshowedthat:VdDM
hadgoodselectivityandsPeeificityfor巧 briodamsela.Afterincubationfor16一24
V川浙江工商大学硕士学位论文
hat37“C，the巧 briodamselaformedgreeneoloniesonVdDM.TheothersPecies
ofbaeteriadidnotformcoloniesorformedyelloweolonies.VdDMshoweda
meanPlatingefficieneyof巧brio由 mselaeellsof(83.46士 3.42)%anditsdetection
11而 twaslolc细毗.Accordingl丫 vdnM15suit汕le几 rkindsofinspection
agenciestodetect巧 briodamselawiththestrengthensofbeingeasily一oPerated，
lowereost， convenienceforobservationand50on.
ComParedwiththeconventionalmethods(TCBSeombinedwiththeAPIZOE
systemorbioche而 stryassessorofVibrionaceae)，巧 brioenrichmentmedium15
combinedwithfourSeleetiveDifferentialmediasresPectively， whieheanbeused
toisolateanddeteetPathogenie巧brio.Meanwhile， iteanbeideniifiedwith
severaladvantages:easily一oPerated，econo而cal， eonvenientforobservation.high
sensitivityandsPecifieity.
KEYWORDS:SelectiveDifferentialMedium;Pathogenie巧 brio;Rapiddetection;
巧 briovuln沪cus;巧brion，imicus;巧 briocincinnatiensis;巧 briodamsela
lX
‘浙江工商大学硕士学位论文
目录
第1章绪论..……”._…-”....-....……”..…~..…-“..，............……“…”...........……“_…”……”二”.…“”二”””“_.1
1.1食品安全与细菌性食物中毒..............

..............................................................……!，.，...................……1
1.2几种重要致病性弧菌的危害及其检测现状................................................................................……l
1.2.1创伤弧菌...............................................................................................................................……2
1.2.1.1创伤弧菌及其危害...............................……，................................................................……2
1.2.1.2创伤弧菌的检测现状.....................................……，.........................................................……3
1.2.1.3现有检测方法存在的不足.............................……，..……，..............................……，............……
1.2.2拟态弧菌............................................................................................................................……4
1.2.2.1拟态弧菌及其危害...................……，..................……，................................................……，……4
1.2.2.2拟态弧菌的检测现状二，........................................................................................……‘.、5
1.2.2.3现有检测方法存在的不足...................................……，...……，.......................................……，二5
1.2.3辛辛那提弧菌.....................................................................................................................……6
1.2.3.1辛辛那提弧菌及其危害.........……，......……，...................................................……，..........……石
1.2.3.2辛辛那提弧菌的检测现状..........................................................................……，............……6
1.2.3，4现有检测方法存在的不足..…_.........……，..............……，..............……，.............................……6
1.2.4海鱼弧菌..…，.............................................................................…… _...............……，..……，....……6
1.2.4.1海鱼弧菌及其危害............................................……_.....................................................……石
1.2.4.2海鱼弧菌检测现状.....................……_.，....……，............................................................……7
1.2.4.3现有检测方法存在的不足..............................……，...........................................……，，..……7
1.3选择性鉴别培养基概述...................……， ...................……，........................................................……，…8
1.3.1选择性鉴别培养基的基本原理.......……，..................................……，.................……，.............……8
1.3.2选择性鉴别培养基的研究现状............

...............................................……_.........................……9
1.3.2.1弧菌属细菌检测选择性鉴别培养基.……，.........……_....……，..……_................……，............……9
1.3.2.2创伤弧菌选择性鉴别培养基............................……，.......................................……，.......……9
1.3.2.3副溶血性弧菌选择性鉴别培养基..............................................................................……，.10
1.3.2.4其它致病菌的选择性鉴别培养基._.............................................................................……10
1.4课题研究内容、意义及创新点....................................................……，...........................……，....……10浙江工商大学硕士学位论文
14.1选题背景与意义.......................................................................................……，..……，.........……10
1.4.2研究目标与方法..............................................................................................................……11
1.4.2.1项目研究目标..............................................................................................................……11
1.4.2.2研究方法.....................................................................................................................……11
1.4.2.3技术路线.....................................................................……，........................................……12
1.4.3本研究的创新点.................................................................................................................……13
第2章致病性弧菌增菌培养基及培养条件的改进研究...……”_.……“.”.…”..……”.“.。……”””.....…….”.15
2.1试验部分...................................................................……，.......................................................……巧
2.1.1试验材料......................................................................................................……，........……，.……巧
2.1.1.1试验菌株...............................................................................……，..................……，......……巧
2.1.1.2培养基、试剂与仪器设备........................................……，.....……，................................……巧
2.1.2试验方法...................................................................................................……，...................……16
2.1.2.1菌体浓度测定方法..........................................................................……，...........……，.……16
2.1.2.2培养条件对弧菌增殖的影响.............……，..................................................................……16
2.1.2.3胰蛋白脉与鱼蛋白陈配比对弧菌增殖的影

响…，.......................................................……16
2.1.2.4酵母浸膏用量对弧菌增殖的影响...........................................................................……16
2.].2.5正交试验设计................................................................................……_.......................……17
2.1.3验证试验....................................................……，..................................................................……17
2.1.3.1优化的VEM增菌效果的验证方法................……，.....................................................……17
2.1.3.2不同弧菌对优化的VEM的验证................................................................……，........……18
4正交试验极差分析法
5方差分析..............……
......……，…18
·‘··。··.……18
2.2结果与讨论...........................................................................................................................……18
2.2.1培养条件的优化结果...........................................................……，..............................一.........……18
2.2.2胰蛋白陈与鱼蛋白陈配比对副溶血性弧菌增菌效果的影响..........................……，....……_……19
2.2.3酵母浸膏对副溶血性弧菌增菌效果的影响................……，.…，............................................……19
2.2.4正交试验设计与结果......……_.....................................……_....................……，.....................……20
2.2.5优化的VEM对副溶血性弧菌增菌效果的验证...................................……_，............……，二，..…21
2.2.6优化VEM对不同致病性弧菌增菌效果的验证..............................................……，...........……22
2.3小论......................................................……，..........................................……，..................……，..…23
】】浙江工商大学硕士学位论文
第3章创伤弧菌选择性鉴别培养基的研制_…，...........……”..…“一“….…”……”.....……”.…“.…“”.…25
3.1试验部分............................……，..................................................................................................……25
3.1.1试验材料...........................................................................................................................……25
3.1.1.1菌株....……‘..........……、.-……，、.、…、二、.......................................................……25
3.1.1.2主要培养基、试剂、仪器设备与样品.......................……，...........................................……25
3.1.2试验方法....................................................................……，.....................……，.....................……26
3.1.2

.1丫勺DM的设计与配制....................................................................................................……26
3.1.2.2其它培养基的配制................................……，...……，......................................................……27
3.1.2.3、勺DM对各种致病性弧菌特异性测试.......................................................................……28
3.1.2.4出菌效率(平板效率;Pla”ngefficie仗y)测定方法...................……，....……，................……28
3.1.2.5CPC、n〔PC与丫勺DM检测创伤弧菌的精确度的对比...........................................……28
3.1.2.6丫勺DM在检测水产品中拟态弧菌的精确度及灵敏度的测定......................................……28
3.1.2.7、勺DM对实际样品的检测...........……，..................................……，.................................……29
3.2结果与讨论...……，........................……，.，..................................................................................……29
3.2.1、勺DM对不同菌株的特异性测试...................................................................................……29
3.2.1.1勺勺DM对创伤弧菌的选择鉴别效果二_........……，................……，，...................................……29
3.2.1.2VvDM对弧菌属以外的主要食品致病菌选择鉴别效果.......……，..............................……31
一 3.2.2VvDM的出菌效率结果.......……，..……
32.3丫冲DM、CPC与mCPC检测创伤弧菌的精确度对比结果...........……
3.2.4、勺DM在检测水产品中拟态弧菌的精确度和灵敏度的结果........……
.........……32
.....……，…33
3.2.4.1纯菌污染样品的精确度和灵敏度检测结果..........................……
2.4.2混合菌液污染样品的精确度和灵敏度检测结果二
....……33
....……33
3.2.5丫IvDM检测实际样品中创伤弧菌的结果.......……
一3小结
第4章拟态弧菌选择性鉴别培养基的研究.…-_.一....……_.....一.......一_............一..一.........................……7
，了，产气、︶，J4.1试验部分.....................……
4.1.1试验材料........................................……
4.1.1.1菌株..........................……，...........……_.......……
4.1.1.2培养基、试剂、仪器设备与样品..............……
.........……37
.........……37
4.1.2试验方法……，.....……浙江工商大学硕士学位论文
4.1.2.1VmDM的设计与配制.............................................……，.............................................……38
4.1.22其它培养基的配制....................................................................................................……39
4.1.2.3VmDM的特异性测试.................……，............................................

........................·..……39
4.1.2.4V加DM的出菌效率测定方法.....................................................................................……39
4.1.2.5VmDM在检测水产品中拟态弧菌的精确度及灵敏度的测定.……，......……，..............……40
4.1.2.6VmDM对实际样品的检测…，..................................................一……‘二，.…、.............……40
4.2结果与讨论.....................................……，......……，......……，..........................................……40
4.2.1VmDM的特异性测试结果.、...............................................................................……，.........……40
42.1.IV功DM对致病性弧菌的选择鉴别效果....................................................................……41
4.2.1.2Vll们M对弧菌属以外的主要食品致病菌选择鉴别效果............................................……41
4.2.2v初M的出菌效率结果…，...........................................................···.··································……43
4.2.3Vll心M在检测水产品中拟态弧菌的精确度结果和灵敏度...............................................……43
4.2.3.1纯菌污染样品的精确度和灵敏度检测结果..................……，……
4.2.3.2混合菌液污染样品的精确度和灵敏度检测结果..……，.......……
..........……43
..........……43
4.2.4Vn们M检测实际样品中拟态弧菌的结果.....................................……，.……，......................……44
644.3小结
第5章辛辛那提弧菌选择性鉴别培养基的研制…”…._”二”一~一”。._一.….”.~一””..….“.一~二”“.，47
5.1试验部分.....................................................................................................................……，.........……47
5.1.1试验材料..............……，.....................……，........................................................................……47
5.1.1.1菌株......................................……，..........……，........……_..............................................……47
5.1.1.2主要培养基、试剂、仪器设备与样品......................................................................……47
5.1.2试验方法.......................................................................................................................……，48
5.1.2.1VciDM设计与配制........……_..............................……，.…_............................................……48
5.1.2.2其它培养基的配制...........……，……，...............……，.......................................................……49
5.1.2.3VciDM对各种致病菌特异性测试...............................................................................……

49
5.1.2.4辛辛那提弧菌在VciDM上的出菌效率测定方法...................................................……49
5.1.2.5VciDM在检测水产品中辛辛那提弧菌的精确度及灵敏度的测定一，二，..............……，..……50
5.l.2.6Vc山M对实际样品的检测..................................................................................……，..……50
5.2结果与讨论二_.........……，…，..................................................……_..............……__.........................……51
5.2.IVc泊M对各种致病菌特异性测试...............................................................……，..................…51
IV浙江工商大学硕士学位论文
5.2.1.1VciDM对致病性弧菌的选择鉴别效果.......................................................................……51
5.2.1.2Vc山M对弧菌属以外的主要食品致病菌的选择鉴别效果.........................................……51
5.22辛辛那提弧菌在VCIDM上的出菌效率结果...................................................................……53
5.2.3Vc山M在检测水产品中辛辛那提弧菌的精确度和灵敏度.......................……，..................……53
5.2.3.1纯菌污染样品的精确度和灵敏度检测结果.................................................................……53
5.2.3.2混合菌液污染样品的精确度和灵敏度检测结果........................................................……53
5.2.4Ve刃M检测实际样品中辛辛那提弧菌的结果..…，..............................................................……54
5.3小结二，.....................................................……，....................……，............................................……，..……56
第6章海鱼弧菌的选择性鉴别培养基的研制.…”….…-”.”二”.“…”....一.……”“.”一“…“..一“..…”””.57
6.1试验部分...........................................................................................……，.....................................……57
6.1.1试验材料..........................................................................……，..........……，..........................……57
6.1.1.1菌株.....................................................................................……，................................……57
6.1.1.2主要培养基、试剂、仪器设备与样品..................……，..........................……，..........……57
6.1.2试验方法.............................................................................……，..........................................……58
6.1.2.1VdDM设计与配制._............……，.......................................……，二，...............……，.....……，……58
6.1.2.2其它培养基的配制......................................……，..........

...……_........................................……59
6.1.2.3VdDM对各种致病菌特异性测试.……，.........................................................................……59
6.1.2.4海鱼弧菌在VdDM上的出菌效率测定方法.......................................……，.................……59
6， 1.25VdDM在检测水产品中海鱼弧菌的精确度及灵敏度的测定......................................……60
6.1.2.6VdDM对实际样品的检测.....................................................……_.…，.......................……，二60
6.2结果与讨论._.....……，..…，二，.......................................................................................................……60
6.2.1VdDM对各种致病菌特异性测试.，..…，...........................................……，.........……，.............……60
6.2.1.1VdDM对致病性弧菌的选择鉴别效果...................……，..........................................……，二60
6.2.1.2VdDM对弧菌属以外的主要食品致病菌选择鉴别效果..........……，.…，二，.............……，.，.…61
6.2.2海鱼弧菌在VdDM上的出菌效率结果..................................……，.....................................……63
6.2.3VdDM在检测水产品中海鱼弧菌的精确度和灵敏度........................................................……63
6.2.3.1纯菌污染样品的精确度和灵敏度检测结果.................................................................……63
6.2.3.2混合菌液污染样品的精确度和灵敏度检测结果.........................................................……63
6.2.4VdDM检测实际样品中海鱼弧菌的结果.…，....................................……_.......……_...........……以
6.3小结.……_.....……，...............……，.......................……_.…，.............................................................……66
V浙江工商大学硕士学位论文
第7章课题总结与展望.…”……_........……~........……””..............一.................……”......................……“二”.67
l课题总结...................................................................……，……，........................................................……67
2课题展望................................……，..................................................................................................……68
参考文献..…””…”.“....……”““..……”.........…….“.“二”.”，.“…”.““…”...............……”“……“.”.….””......……69
附录英文缩略表...................................................................................................……”
研究生期间发表论文与申请的专利...........................................................................……7

8
致谢..................................................................................................................……79浙江工商大学硕士学位论文
第1章绪论
1.1食品安全与细菌性食物中毒
1996年，世界卫生组织(WHO)将食品安全定义为“对食品按其原定用途进行制作和食
用时不会使消费者受害的一种担保”川。
食物污染造成的疾病己经成为当今世界上最广泛的卫生问题，而且也是经济生产降低
的主要原因。世界卫生组织2002年3月公布的信息表明，全球每年发生食源性疾病的病
例达到40一60亿例，发展中国家每年约有180万人死于食源性疾病，即使在发达国家每年
也至少有l/3的人患食源性疾病l2]。如:美国每年有7600万人患食源性疾病，导致32.5万
人住院，造成5000人死亡。英国每年有237万人患食源性疾病。发展中国家食源性疾病
发生的情况更为严重，我国没有确切统计，专家估计发病率在500/0以上[3l。全球各地连续
发生的一系列食源性疾病暴发事件:英国的疯牛病、日本出血性大肠埃希氏菌0157:H7
和葡萄球菌肠毒素中毒的雪印牛奶事件等均引起世界范围的震惊。在2007年我国“两会”
上食品安全也成为热点民生话题，代表们指出致病微生物引起的食源性疾病(主要表现为胃
肠炎、腹泻、发烧、呕吐、败血症、痢疾等症状)己经成为中国的头号食品安全问题。食源
性疾病不仅严重危害人们的健康，亦给国家造成重大经济损失l#]。
细菌食源性疾病是指由痢疾杆菌、伤寒杆菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠
杆菌、霍乱弧菌和肠出血性大肠杆菌等致病菌引起的食源性疾病，在发达国家和发展中国
家均有暴发流行;尤其是近年来，美国和日本大肠杆菌0157:H7食物中毒和葡萄球菌肠
毒素中毒的雪印牛奶事件等都充分说明，细菌食源性疾病是食品安全面临严峻的挑战15】。
据解放军302医院传染病专家刘士敬博士介绍，近年来，我国卫生部每年都接到食物
中毒报告100一200起，涉及数千人发病，百余人死亡，除意外事故外，其中大部分由致病
微生物引起。监测结果表明:在众多的食源性疾病中由细菌引起的疾病占35%一75%，其中
致病性弧菌污染的水产品占270/013]，所以，加强对致病性弧菌卫生安全检测己迫在眉睫。
2几种重要致病性弧菌的危害及其检测现状
弧菌属(genus巧brio)的细菌形状短小，约0.5“mx(l一5)林m，因弯曲如弧而得名。弧
l浙江工商大学硕士学位论文
菌属包括的弧菌种类多，目前已经定名的多达37种16，7]，分布广泛，海水中最为常见;其中
多数不致病，己经证明对人类具有致病性的弧菌主要包括霍乱弧菌(巧bri口cholerae)、拟态
弧菌(巧b对 0mimscu

s)、梅氏弧菌(巧 briometschnikovii)、霍利斯弧菌(巧 bnohollisae)、海鱼弧
菌(巧b对口d匕脚sela)、河流弧菌(巧brio介vialis)、弗尼斯弧菌(巧bri口fuoissii)、副溶血性弧菌
(巧brio胆 rahaemolyticus)、溶藻弧菌(励rioa勿nolyricus)、创伤弧菌(巧b对 0vuln功eus)、辛辛
那提弧菌(巧b万 0eineinnariensis)和鳖鱼弧菌(巧吞ri。ca陀ha汀ae)12种16，，，8，9]，且12种致病性弧菌
的致病性差别较大，所致疾病的种类和毒性亦差别较大。致病性弧菌引起的疾病主要集中
在夏季的沿海地区，通常成为食源性疾病的首要致病因素，在我国浙江、福建、天津、山
东和广东等地均有爆发。目前，除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外，许多国家已经开始
关注其他致病性弧菌在食物中的存在问题。例如，早在1997年欧共体委员会通过的368决
议(97/368尼C)中明确规定:“各成员国必须使用适宜的抽样计划和检测方法对冷冻或加工
的水产品进行微生物检验，以确保有关产品不存在对人类健康的危害，如沙门氏菌属和弧
菌属是否存在”。l’”】因此，致病性弧菌的检验越来越受到重视。现在主要介绍与本文相关
的四种致病性弧菌的危害及其检测现状:
1.2.1创伤弧菌
1.2.1.1创伤弧菌及其危害
创伤弧菌是一种嗜盐性细菌，分布于近海和海湾的海水、海底沉积物、浮游生物及海
产品(鱼类和贝类)中!”，’2】。由Farme:等于 1979年首先报道!6，1习，此后在沿海地区陆续有此
菌引起的病例出现I’4·’51，是夏秋季沿海地区引发食物中毒的首要病原菌。已研究表明，海
水、牡蝠等贝壳类动物是创伤弧菌感染性疾病的主要媒介，感染主要途径为生吃牡蝠等海
鲜和经过肢体破损创口、海鲜刺伤肢体接触海水I’6]。
创伤弧菌为革兰氏阴性、无芽抱、具有鞭毛的短杆状弧菌。最适宜的生存条件为37“C
下、109几一209几盐度。在0%、8%、10%NaCI的蛋白陈水中不生长，在含3%一6%NaC!
的蛋白陈水中生长良好。其生化特征与副溶血性弧菌和溶藻弧菌极为相似，其中最显著的
不同点为该菌发酵乳糖，故曾称其为乳糖阳性弧菌l’7]。
食用被创伤弧菌污染的食品而引起的食物中毒是最为严重的食源性疾患之一。创伤弧
菌可造成原发性败血症、伤口感染及肠胃感染三种不同的临床表现l’8.’9]，死亡率高达
50%一67%。临床调查表明创伤弧菌的感染途径有二:一是经口感染，创伤弧菌可以通过进
食生的、不熟的或污染的牡砺穿过胃肠道勃膜进入血液，并在短时间内出现败血症和蜂窝
组织炎、出血性大疮，几天内病人便出现感染性休克直至死亡:二是通过破损的皮肤伤口浙江工商大学硕士学位论文
接触存在创伤弧菌的贝类或

海水而感染，在原皮肤伤口处形成红肿、红斑和剧烈疼痛，发
展迅速，最终能引起败血症1201。
创伤弧菌的感染有明显的季节性，主要集中在5一10月份，这段时间水温较高，有利
于该菌的生长，而在水温低于 8OC的环境中检测不到该菌的存在12’]。实验室研究认为在温
度低于10“C时，创伤弧菌就会进入非可培养状态(VN~BC)，此时，该菌的形状也由杆状
变为球状，并且细胞膜的脂肪酸成分也发生改变，细胞壁的机械抵抗能力增强，氨基酸转
运减少。进入非可培养状态与营养水平无关，随着环境温度的逐渐升高，该菌又会复苏120润。
LZ.LZ创伤弧菌的检，ll现状
目前国内没有制定创伤弧菌的国家标准方法，2007年刚颁布两项行业标准:食品中多
种致病菌快速检测方法的PcR法123]和食品中致病菌检测方法的实时PcR法1241;而国外关
于创伤弧菌的检测具有代表性检验的方法也只有美国食品及药物管理局(FDA)、美国官方
分析化学师协会(AoAC)、日本、加拿大和北欧食品分析委员会(N侧眼L)分别制定的方法125]。
FDA、日本、加拿大与NM眼L分别采用纤维二糖一多粘菌素B一勃菌素(CPC)琼脂、改
良CPC琼脂、纤维二糖一多粘菌素E(CC)琼脂和硫代硫酸盐一柠檬酸盐一胆盐一蔗糖琼脂 (TCBs)
选择分离培养基方法18，26，2vl;这种检测方法相对准确性高，但在分离培养后还要进行生化图
谱、针对whA基因的PCR引物或DNA探针菌落杂交鉴定等，操作过程比较繁琐l8]。AOAC
采用创伤弧菌的脂肪酸气相色谱鉴定法(AOAc.1995.b)测定，该方法准确性高，但样品预
处理要求严格，比较繁琐，而且仪器设备昂贵。
1987年，Massad等128]采用CPC作为分离创伤弧菌的新培养基，但CPC不适合于从含
创伤弧菌量较小的样品中分离检测创伤弧菌。1991年，TamPlin等t291对cPc琼脂进行改良，
并对改良的CPC琼脂命名为mCPC。此培养基的选择效率高于CPC琼脂培养基，但培养
基上出现的杂菌稍多。 1998年，枷i等130]又对mCPC琼脂进行改良，发展出cC琼脂，但
此培养基上出现生长状况较好的杂菌较多，不易获得纯菌株。综上三种培养基在分离环境
样品中低浓度创伤弧菌时都不能同时具备较高的灵敏度和特异性13’l。
1987年，Motris等132】采用来源于创伤弧菌溶细胞素基因。 hA32P标记的长3.2kb的
DNA探针，结果显示，whA探针具有种特异性。但是放射性物质的使用限制了该探针在
普通实验室中的应用。1991年，Hill等哪l根据位于 1.8kbHin。n片段的二hA基因的核昔
酸序列设计引物对，5’ eegcggtac笔 9ttgg铭ca3’和5’ cgceaeeeaettteggge。3’，对创
伤弧菌进行PcR，检出限为100。彻g。 1993年，wright等1341根据创伤弧菌溶细胞素结构

基因whA的序列， gagetgtcacggcagttggaacca，合成了创伤弧菌碱性磷酸酶标记寡核昔浙江工商大学硕士学位论文
酸探针(V丫人p)。试验结果表明，该探针可特异地与18株创伤弧菌分离株的DNA杂交，对
47株非目标弧菌不反应，探针杂交结果与脂肪酸图谱和AP12OE生化图谱的鉴定结果一致。
1995年Parker等135]采用兔和羊抗创伤弧菌溶血素(VVH)的多克隆抗体，建立了检测环境样
品中创伤弧菌的夹心EUSA法;该方法的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别
为95%、99%、98%和98%。1998年Ta娜lin等tzg]建立了采用创伤弧菌特异性单克隆抗体
FRBT37的酶免疫法(EIA)，该法的最低检出限为2000个菌/孔。2003年，e印rnpbe一等I，61
靶定用于V劝汗探针的whA基因序列区域，建立了定量检测创伤弧菌的Ta甲讨an实时PcR
方法，检出限为 100cfo/g。2005年，何闪闪等1371采用PcR技术，选用溶细胞毒素基因做
为目的基因来检测水产品中的创伤弧菌，该方法具有灵敏度高，特异性强的优点。
1.2.L3现有检测方法存在的不足
目前常用于分离创伤弧菌分离的选择性培养基主要是TCBS、CPC、mCPC和CC，但
这些培养基共同存在二个问题:特异性较低，分离的菌株杂菌较多或呈假阴性:如创伤弧
菌在TCBS琼脂平板上生长时很像副溶血弧菌，只能通过一些生化反应把两者区分开来;
在CPC琼脂培养基还混有其它杂菌，而在mCPC琼脂培养基则有部分呈假阴性，如E型
创伤弧菌(serovarE、Bi。帅 e2)138]。其他快速检测方法相对检测周期缩短，但这些方法所
需的试剂耗材和仪器都较昂贵，检测成本非常高，而且需要非常专业的人员操作，难以广
泛应用于检测部门，特别是基层检测机构和企业。
1.2.2拟态弧菌
1.2.2.1拟态弧菌及其危害
拟态弧菌又称最小弧菌，是一种非嗜盐性弧菌，广泛分布于自然界河水、海水以及海
产品中，是十二种致病性弧菌之一。D洲s等于1981年首次从腹泻患者粪便中分离到的
新病原性弧菌16，81。】991年Thune等首次报道该菌感染鳌虾能引起养殖鳌虾大量死亡139)。
拟态弧菌系革兰氏阴性弧菌，具有单鞭毛，有动力，不形成荚膜和芽胞，大小为(0.5一0.8)
林mX(1.5一3.0)林m，生长温度范围为20“C一37“C，最适生长温度为28“C，pH范围为7.0一9.0，
最适pH为7.5一8.0。在无盐和l%弓%NaCI蛋白陈水中生长良好，在6%NaCI蛋白陈水中
有50%生长，在8%以上NaCI蛋白陈水不生长仁，0l。
研究表明，拟态弧菌的致病性是由多种毒力因子共同作用的结果，其中粘附素、溶血
素和肠毒素是其主要毒力因子14’l。可引起人类的腹泻、中耳炎、外伤感染和水生生物的弧
菌病(环bl万0515)17.421，引起鱼类、甲壳类等水产动

物严重的腹水病1431，还可以通过水产动物
或水产品感染人类，引发肠道传染病或食物中毒，潜伏期3h一72h，平均24h。主要症状浙江工商大学硕士学位论文
有腹泻、呕吐及腹痛，大便呈水样或粘液血便。发病年龄不限，但小儿少见。发病者多有
吃生牡虾、虾、蟹史。在美国、北美、新西兰、孟加拉及非洲国家均有病例报道。我国福
建、北京、上海、江苏及浙江地区也有发病137]。多呈散发或暴发，一年四季均有发病，以
夏季为多。
2004年8月2日下午5时，奉化市某企业多名职工在该企业食堂就餐后陆续出现呕吐、
腹痛和腹泻等症状，根据流行病学调查、临床症状及实验室检验结果，确定是由拟态弧菌
污染食物引起的食物中毒I’4l。2006年6月18日，漳浦县几个乡镇中心幼稚园的老师共43
人，集中到某乡镇开教研会议，午饭在该镇供销招待所就餐，19日凌晨相继出现以腹绞痛，
腹泻(水样便)，恶心、呕吐、头晕头痛等主要症状。根据流行病学调查、临床症状及实验
室检验结果，确定为副溶血性弧菌、拟态弧菌引起的食物中毒[’5]。
1.2.2.2拟态弧菌的检测现状
现在国内外关于拟态弧菌的国家标准和行业标准检测方法尚没有明确规定，通常也是
用常规的生化培养鉴定方法，如目前常用的选择性培养基TCBSI，6l，但现有的选择培养基
特异性较低，分离的菌株杂菌较多，还需要一些繁杂耗时的生化反应鉴定。目前，有些成
熟的微生物快速鉴定系统已经被应用于拟态弧菌的检测并得到认可的主要有法国梅里埃
的 Apl20E和全自动微生物分析仪(VI花K)等“7]。
2003年吴后波等!4“]建立了点酶法检测拟态弧菌vm-Pm毒素的方法，该方法可在拟态
弧菌培养上清检出毒素，可检出的最低含量为0.025“岁呱，2007年任春华等1491建立了一
种用环介导等温扩增方法检测拟态弧菌的方法，检测方法包括细菌DNA的提取、拟态弧
菌的环介导等温扩增、显色检测。2009年郑秋月等150]应用PCR结合变性高效液相色谱
(DHrLC)技术对食品中拟态弧菌进行检测，用DHPLC技术分析拟态弧菌特异性PcR扩增
产物，该方法有很好的特异性。
1.2.2.3现有检测方法存在的不足
目前常规微生物学检测方法中的选择性培养基TCBS，目的是为了分离致病性弧菌，
特异性不强，需要对其上的所有可疑菌落进行生理生化特征鉴定目标菌，不适宜大量样品
的分析，且费时费力不够经济”’]。虽然现在市面上有比较方便的生化反应系统，如AP12oE
与viTEK，其检测成本高，不适合推广应用。现有快速检测方法环介导等温扩增方法与
PCR一DH甲LC技术，虽然检测周期是大为缩短，但这些快速检测方法仍样品

预处理复杂和
所需仪器价格昂贵，更重要的是还需要具有一定专业技术的人员才能实现检测，不利于这
种方法在基层的普级应用。浙江工商大学硕士学位论文
1.2.3辛辛那提弧菌
1.2.3.1辛辛那提弧菌及其危害
辛辛那提弧菌系革兰氏阴性弧菌，不产芽胞，具有单鞭毛，有动力，与副溶血性弧菌、
霍乱弧菌一样，属常见海洋细菌，广泛分布于海水以及海产品中，是嗜盐菌卿。该菌在无
NaCI培养基上不生长，在l%一6%的NaCI浓度的培养基上生长良好，在TCBS琼脂平板上呈
黄色，菌落直经为1一2~。1986年Bruyton等从1例患菌血症和脑膜炎的70岁的男性病人的
血液和脑脊液中分离到辛辛那提弧菌19.52]。
辛辛那提弧菌可引起人类的肠胃炎、伤口感染或败血症和水生生物的弧菌病
(巧briosis)19.25]。主要症状还没明确，但与腹泻、呕吐及腹痛有关系1531。发病年龄不限，但
小儿与老年人常见152，s3问，且受害症状较严重。
自90年代初开始图们出入境检验检疫局每年都要对图们江水进行若干次监测，在1994
年与2001年先后两次在图们江水中分离出辛辛那提弧菌各l株l’5，56]。2001年毛芝娟等[57]
在宁波市锯缘青蟹(介夕 llaserl， atea)主要养殖海区5一9月间不同症状的病蟹体内致病菌分离
检测，得出辛辛那提弧菌等是“黄水病”的病原。
钱玉春等1581曾在2000年5月至2001年9月在合肥市采集81份水样、126份熟食样品
进行致病性弧菌分布调查，结果检出辛辛那提弧菌7株。
1.2.3.2辛辛那提弧菌的检测现状
综观国内外，目前没有一个国家或部门机构制定专门针对辛辛那提弧菌的鉴别检测的
标准或方法。目前各研究部门在分离鉴别辛辛那提弧菌时常用常规微生物学检测方法，其
分离培养基常用嗜盐菌选择性琼脂和TCBS琼脂等l’6.5”1，但这些培养基只是适用于弧菌属细
菌的分离，而非专门用于分离辛辛那提弧菌。
1.2.13现有检测方法存在的不足
目前常用的嗜盐菌选择性琼脂和TCBS选择分离培养基，在分离检测辛辛那提弧菌时，
这三种平板上形成的菌落中包含大量的弧菌属的其它种细菌，如溶藻弧菌、霍乱弧菌和河
流弧菌等;并且难以判断出可疑菌落，并且还要对可疑菌落进行大量生化试验，进行进一
步确认是否有海鱼弧菌，其操作过程繁琐，耗时较长，无论在效率还是在经济上都不具有
优势。
1.2.4海鱼弧菌
1.2.4.1海鱼弧菌及其危害浙江工商大学硕士学位论文
海鱼弧菌又称美人鱼弧菌或美人鱼发光杆菌 (Photobacte对um由msela)lv，591是一种嗜盐
性细菌，广泛存在于热带海洋近海沿海海岸附近及寄生于海生动物中，与副溶血性弧菌、
霍乱弧菌一样，属常见海洋细菌，

该菌为革兰氏阴性弧菌，具有单鞭毛，有动力，在显微
镜下为或弯曲状宽，约(0.5一0.8)拼 mX(1.4一2.6)林m，在无NaCI和8%以上NaCI浓度的培养
基中不生长，在l%NaCI培养基中生长良好。该菌通常以耐盐试验、氧化酶、硝酸盐还原、
精氨酸、v一p、西蒙氏拘椽酸盐、L一阿拉伯糖、D一甘露酶和葡萄糖产气与其他种别区分19，60]。
1981年Love首先从加州海岸的海鱼(又名珊瑚鱼)皮肤损伤处分离出海鱼弧菌l6，刀。有
资料表明16’，62]海鱼弧菌具有组织侵袭力，并可产生大量的溶细胞素，在理化性状与抗原性
上不同于其他弧菌所产生的细胞毒素。它可致海洋鱼类皮肤溃疡和人类伤口感染，称之为
“人鱼共患病原体”163，6’，65，66，67]。人类患病个体临床上一般症状较轻，表现为腹泻，大便呈
黄水样，量较多，少数伴有勃液或勃液脓血，少数病人有里急后重，可伴有呕吐，大便常
规可见少许红细胞和白细胞。大多数病人伴有阵发性加剧的脐周疼痛和左下腹压痛，大便
常规检测可见少许红细胞和白细胞168]。
1982一1984年在美国海鱼弧菌曾引起16起感染事件，并导致4人死亡169]。温来欣等170】
于2000年5一10月随机对天津市河西区卫生防病中心下属医院肠道门诊的 985例急性腹泻病
患者进行针对弧菌科细菌的调查，结果检测出海鱼弧菌14株，占所有样品的1.42%。郝秀
红等17’】于2001年4一10月对中国某海域海水进行了细菌谱调研，海鱼弧菌检出率居第三位，
占6.9%，为海洋优势菌，并对此进行了毒力实验及伤口感染实验。结果表明，海鱼弧菌具
有组织侵入力，同时对动物还有较强感染力。2001年9月，殷淑权等172)在一例腹泻病病人
身上分离到一株海鱼弧菌，主要症状为平均每小时腹泻5一7次，大便为米潜水样便，呈喷射
状，不带血;经流行病学调查和实验室诊断，认定该菌就是该例病人的腹泻病原。
1.2.4.2海鱼弧菌检测现状
目前国内外尚无专门鉴别检测海鱼弧菌的国家或行业标准。日常分离鉴别海鱼弧菌常
用的嗜盐菌选择性琼脂、TcBs培养基18，7，，74，75，76]，虽然可以初步分离到海鱼弧菌[46l，但非
专门用于分离海鱼弧菌，因此，对海鱼弧菌而言，特异性较低，分离培养物中含杂菌较多，
如溶藻弧菌、霍乱弧菌和河流弧菌等;还需要通过一些繁杂耗时的生化试验才能分离鉴别
出海鱼弧菌146一74一751。
1997年日本松同，学等I7vl成功地应用RT.pCR技术检测长背脚沙11口，la内中的海鱼弧
菌，其检出限为 101cfu/mL。
1.2.4.3现有检测方法存在的不足浙江工商大学硕士学位论文
目前常用的嗜盐菌选择性琼脂、TCBS分离鉴别海鱼弧菌，在嗜盐菌选择性琼脂、TC

BS
上形成的菌落中难以判断也可疑菌落，并且还要对可疑菌落进行大量生化试验，进行进一
步确认是否有海鱼弧菌，其操作过程繁琐，耗时较长，无论从效率还经济上都不具有优势。
PCR技术虽然在鉴定上有相对时间短的优势，但受目的菌株特异性基因的限制，也难以对
海鱼弧菌的所有菌株进行鉴别，并且受PCR技术的操作精细的要求，也难以达到广泛运用。
1.3选择性鉴别培养基概述
选择性鉴别培养基是在生化反应基础上开发出来的一种技术，它将传统的细菌分离培
养与生化反应有机的结合起来，使得检测结果直观，易于观察辨别，且具有低成本、特异
性强、灵敏度高、检测快速和操作方便等优点。目前许多国家都有选择性鉴别培养基的开
发、研究和销售公司，如法国的法国科玛嘉公司、法国梅里埃公司、广东环凯微生物科技
有限公司、青岛海博微生物科技有限公司等，并逐步将之引入到各种国际和国家检验标准
中，其作为一种良好的微生物快速检测技术己得到了广泛的认可l;8j，也是国内外微生物检
测研发的主要方向之一。
1.3.1选择性鉴别培养基的基本原理
选择性鉴别培养基是根据不同种类的细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特
异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的分离培养基中，
对微生物进行快速检测的一种鉴别培养基，减少了进行纯培养和生化鉴定的步骤，大大提
高了检测效率Iv8·79.80]。
选择性鉴别培养基的基本原理包括基础营养需求和特殊生态环境、特殊生化反应即酶
系统和代谢特点及对特定抑菌物质的耐受性等方面。
(l)营养需求和特殊生态环境:由于各种细菌对营养要求并不完全相同，其基础培养
基及生态环境也不相同，所以在选择性鉴别培养基的设计中也要充分考虑目标细菌的营养
需求和特殊生态环境。如非嗜盐菌与嗜盐菌，非嗜盐菌的基础培养基中只需要微量的无机
盐做为生长因子，而嗜盐菌的基础培养基中需要足量的无机盐维持其生态环境中的渗透压
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(2)特殊生化反应即酶系统和代谢规律及其指示系统:微生物具有复杂多样的酶系统，
酶的种类及反应条件可作为微生物分类鉴定的重要依据。根据细菌在其生长繁殖过程中可
合成和释放某些特异性的酶，按酶的种类和特性，选用相应的底物和指示剂，加入到目标
菌的基础培养基中，在目标菌的特异性酶作用下产生代谢产物，并与培养基中的显色剂作浙江工商大学硕士学位论文
用，显示一定颜色:根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反
应的测定结果有助于细菌的