水稻愈伤转化
提高水稻愈伤组织再生频率的研究
提高水稻愈伤组织再生频率的研究
水稻愈伤组织再生技术是一种常用的遗传转化技术，可用于基因工程及育种研究。
然而，水稻愈伤组织再生频率不稳定，成为限制其广泛应用的主要因素。
因此，研究提高水稻愈伤组织再生频率的方法对于促进水稻遗传转化技术的发展具有重要意义。
以下是一些可能有效的方法：
1.培养基优化：选择适宜的植物激素和营养物质组成，可以显著提高水稻愈伤组织的再生率。
2.制备高效再生诱导剂：添加适量的有机溶剂和蔗糖等成分，可以增强愈伤组织的再生能力。
3.细胞超微结构改变：通过电刺激、质膜通透剂等方法，改变细胞超微结构，使愈伤组织再生能力得到提高。
4.分子水平调控：通过细胞进程和信号途径的调控，可提高愈伤组织再生频率。
例如，通过转化适宜的基因，如MYB、PjLOX3和OsARF19等，可以显著提升水稻愈伤组织再生率。
总的来说，提高水稻愈伤组织再生频率的研究需要多种方法的综合应用，通过不同层次的调控，从整体上提高水稻愈伤组织再生能力，以推动水稻基因工程和育种研究的进展。
一就教关于水稻愈伤组织的问题
组培常见英汉对照abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid（二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植体）filter paper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）global embryo （球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture（花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和）shoot tip（茎尖）sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代) sucrose（蔗糖）terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）常用缩略语ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）一、请教关于水稻愈伤组织的问题:我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
一、请教关于水稻愈伤组织的问题
组培常见英汉对照abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid （二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植体）filter paper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）global embryo （球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture （花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和）shoot tip（茎尖）sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代) sucrose（蔗糖）terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）常用缩略语ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）一、请教关于水稻愈伤组织的问题:我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告实验目的：本实验旨在探究水稻愈伤组织的诱导方法，为将来的水稻遗传改造研究提供参考。
实验材料和仪器：1. 材料：水稻种子、MS培养基、植物生长调节剂2,4-D、生长调节剂TDZ、无菌器具、琼脂、无菌操作室。
2. 仪器：无菌操作台、显微镜、实验室平衡器等。
实验步骤：1. 生物材料准备：选取幼苗期生长良好、品种鲜明的水稻种子作为材料。
将水稻种子进行表面消毒，处理方法为分别用70%的酒精和5%的次氯酸钠(1:1)混合消毒3-5分钟，然后充分清洗。
2. 建立组织培养体系：将消毒后的水稻种子在无菌操作台上进行分离培养。
将种子取出后，从胚乳中取出胚轴，用剪刀消毒后放入含有MS培养基的无菌培养瓶中，置于无菌操作室中进行培养。
在35-37°C下连续培养3-5天。
3. 筛选愈伤组织：将培养2-3天的胚轴等植物试管苗等组织放置在含有不同浓度的2,4-D和TDZ的培养基中，培养10-15天。
筛选出生长具有愈伤能力的组织，采用显微镜等方法进行观察，并进行相应的分离和培养。
4. 愈伤组织的维持和复壮：将筛选出的愈伤组织维持在含有2,4-D和TDZ的培养基中，定期进行转移或分离。
当愈伤组织增生至一定程度后，将其转移到不含激素的培养基中，进行复壮。
实验结果：在实验过程中，我们选择了4个不同浓度的2,4-D和TDZ进行培养，筛选出了愈伤组织，并进行了维持、修复工作。
经过5次转移和增殖培养，我们成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
结论：本实验采用的方法可行，成功地建立了稳定的水稻愈伤组织体系。
本研究为今后的水稻遗传改造和抗性育种提供了良好的基础。
水稻愈伤转化
水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。
自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。
用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。
根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。
（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。
）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。
这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。
通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。
农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
实验七 基因枪转化
六、思考题
影响基因枪转化的因素有哪些？
基因枪 （biolistics, particle bombardment, microprojectile)
最早的基因枪是1987年美国康乃尔大学Sanford等研制成 功的火药基因枪，1990年杜邦公司推出其商品火药基因 枪PDS-1000系统。
压缩气体驱动的基因枪（PDS-1000/He）
PDS-1000/He基因枪是美国康乃尔大学Sanford等在原火 药基因枪的基础上设计改装的。它更加清洁、安全、能 更好地控制枪击动力，金属颗粒分散更加均匀，每枪之 间的差异小，且转化效率高。 用于基因枪的压缩气体有氦气、氢气、氮气等，其中氦 气压缩后具有更大的冲力，驱动金属颗粒的速度更高。 PDS-1000/He是利用不同厚度的聚酰亚胺薄膜做成可裂 圆片（repture disk），来调节氦气压力，当压力达到可 裂片的临界压力时，可裂片爆裂并释放出一阵强烈的冲 击波，使微粒子弹载体携带微粒子弹高速运动至钢硬的 阻拦网，微粒子弹载体变形并被阻遏，而微粒子弹继续 向下高速运动，轰击靶细胞和组织。
（4）打开气瓶，调节压力至2000psi；
（5）将易裂片、阻拦网和微弹载体安装进固定装臵中； （6）把培养皿放在托盘上，使愈伤都集中在托盘中间的圆圈 内，将托盘插入倒数第二档；
（7）打开基因枪的电源；
（8）打开真空泵； （9）关闭基因枪的门，按下抽真空键（Vac），当真空表读 数达到25 inches Hg.时，使键臵于“保持（Hold）”档； （10）按下射击键（Fire）直到射击结束； （11）按下放气键，使真空表读数归零； （12）打开基因枪门，取出培养皿，盖好盖子并用封口膜封 好
常用的渗透剂：甘露醇、山梨醇 方法: 生长旺盛的胚性愈伤组织，接种在添加0.4M甘露 醇的培养基中，4~8hr后进行基因枪转化。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化一．愈伤组织的培养1.愈伤组织的诱导成熟水稻种子去壳，用70%酒精处理2min，无菌水冲洗2~3次，再用25%次氯酸钠消毒处理15min，无菌水冲洗5~6次，将种子转到灭菌的培养皿上，于超净工作台上吹干。
接种到诱导培养基N6AD2.5上，28℃暗培养至长出愈伤组织（10 d左右）。
2.继代培养用无菌镊子将愈伤组织转移到继代培养基N6AD2上，28℃暗培养10 d。
继代培养两次后待用。
二．农杆菌的转化及培养1. 取农杆菌LBA4404感受态细胞于冰上融化，并在冰上取50uL感受态细胞于电击杯中，加入2.5uL pHB质粒，冰浴30min，电击，向电击杯中加入800uL SOC 混匀，将混匀后的液体转移至1.5mL离心管中，28℃，200rpm，振荡培养2h，13000rpm离心5min，去掉大部分上清液，用200uL枪头吹打悬浮，涂板于YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)固体培养基上，28℃培养至长出菌落。
2. 挑取单菌落于5mL YEP(Rif 50mg/L, Kan 50mg/L)液体培养基中，200rpm振荡培养过夜，取2mL过夜培养的菌液于100mL相同的YEP液体培养基中扩大培养至OD600=0.5，5000rpm离心5min收集细胞，用N6A CO液体培养基重悬。
三．浸染与共培养1.选择生长状态良好的愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在无菌烧杯中用菌液浸泡，一般浸染时间为10~30min，浸染时要不是摇动。
2.倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液。
3.将吸干菌液的愈伤组织置于铺有一层无菌滤纸的N6A CO固体培养基上，26℃暗培养2~3天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
四．脱菌与筛选1.共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈；2.浸泡于含500mg/L Cef 的N6A CO液体培养基中，在摇床上中速振荡30~60min；3.弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或放在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上，26℃暗培养3周，再转入二筛培养基上26℃暗培养3周。
一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统
植物学通报Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ ２００８， ２５ （３）： ３２２−３３１， ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ收稿日期： ２００７－０６－２０； 接受日期： ２００７－１１－０９基金项目： 国家自然科学基金（Ｎｏ． ３０６７０１８５）＊ 通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｈｏｎｇｋ＠ｉｂｃａｓ．ａｃ．ｃｎ．技术与方法．一种改进的水稻成熟胚愈伤组织高效基因转化系统陈惠１， ２， 赵原１， 种康１＊１中国科学院植物研究所， 光合作用与环境分子生理学重点实验室， 北京 １０００９３２山西师范大学生命科学学院， 临汾０４１００４摘要 以成熟胚愈伤组织为材料的农杆菌介导水稻转化法虽已建立， 但转化频率仍有待提高。
本文以粳稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）品种（中花１０号和中花１１号）的成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料， 对组织培养体系及影响遗传转化的因素进行优化， 建立了一套改进的农杆菌介导的水稻高效遗传转化系统。
农杆菌菌株为ＥＨＡ１０５， 质粒载体是ｐＵＮ１３０１／ ＯｓＲＡＡ１， 其中含有标记基因ＧＵＳ 和筛选基因ＨＰＴ。
愈伤组织诱导培养基为ＮＢＤ２ （ＮＢ＋２ ｍｇ·Ｌ－１２，４－Ｄ）， 继代培养基为ＮＢＤ０．５， 预分化与分化培养基为ＲＥ１ （ＭＳ＋１ ｍｇ·Ｌ－１６－ＢＡ ＋ ０．２５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）和ＲＥ２ （ＭＳ＋ １ ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＮＡＡ＋ ０．５ ｍｇ·Ｌ－１ ＫＴ ＋ ０．２ ｍｇ·Ｌ－１ ＺＴ）。
另外， 还分析了影响Ｔ－ＤＮＡ转移的多种因素， 如外植体种类、愈伤组织预培养基和愈伤组织继代次数等。
采用优化的转化程序， 水稻愈伤组织转化率和植株转化率可达７０％以上。
水稻的遗传转化
水稻的遗传转化1）种子消毒：用75%乙醇浸泡去皮的水稻种子1min（剧烈摇动），再用2.5%的次氯酸钠分别处理两次，每次15min，然后用无菌水冲洗3-5次后均匀铺于诱导培养基上，不宜过多，一个培养皿大概14-20粒。
2）水稻愈伤组织的诱导和继代培养：消毒好的成熟种子在诱导培养基上28℃暗培养25-28天。
待愈伤组织长至合适大小，在培养基中来回剧烈摇动几次，使一些小块愈伤从大的组织块上脱离，从中挑选光滑、淡黄色、较硬、大小在2-3mm的胚性愈伤，均匀铺放在继代愈伤培养基上，28℃避光培养7-8天，即可用于农杆菌转化。
3）农杆菌介导的水稻愈伤组织转化及共培养：刮取已活化3天的农杆菌，放入液体共培养培养基中，用力打散，置摇床摇培0.5-2h，使得菌液的OD600在0.1-0.15（0.125最宜）之间。
将挑选的愈伤组织小粒放入已加农杆菌的液体培养基中，轻轻摇动几次，放置15-20min。
倒去菌液，用无菌滤纸吸干均匀的铺在已加滤纸的共培养基中。
愈伤在共培养培养基中22℃条件下暗培养3天。
4）转化愈伤组织的选择培养：共培养后的愈伤先用灭菌水洗涤三次，后用含头孢500mg/L的灭菌水浸泡30min，期间轻轻摇动，之后用滤纸吸干，均匀铺放在选择培养基上，28℃暗培养10天，之后进行第二次筛选，挑选淡黄色、生长状态良好的愈伤，均匀铺放在含潮霉素和头孢的选择培养基中，28℃暗培养15天。
5）愈伤组织的分化培养：挑选黄色、圆形的愈伤组织，均匀铺放在预分化培养基上，28℃暗培养7天。
之后挑选生长状态良好、淡黄色的胚性愈伤，放入分化培养基上，28℃光照培养30-60天左右，直至转基因小苗长出。
中间每隔25天左右将愈伤转移到新鲜的分化培养基上。
6）水稻的壮苗培养与移栽：将长出的小苗去掉周围的愈伤，在无菌条件下转移到1/2MS的壮苗培养基中，使根部浅插入培养基中，28℃光照培养（14h光/10h暗）。
当苗长至瓶口、约10cm以上时，打开瓶口所覆塑料膜，瓶内加入约1/3 的水，使苗暴露于空中炼化培养。
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2选，以确定EHA105的最优转化条件。
然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织。
结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。
愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。
农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformationof A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,andthe concentration of resuspension solution,freezing time and the thawingtemperature were tested. And then infected mature rice in order to inducecallus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended inCaclbuffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed byGUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has beentransferred into rice.Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验报告
实验目的：
通过诱导方法获取水稻愈伤组织，为后续的基因转化等实验打下基础。
实验材料和设备：
水稻种子、MS培养基、2,4-D溶液、NaClO溶液、无菌操作
器材、显微镜等。
实验步骤：
1.种子消毒：将水稻种子放入1% NaClO溶液中浸泡10分钟，再用去离子水洗净后，放进无菌操作室中。
2.种子发芽：将消毒后的种子放进含有营养的MS培养基中，
在25℃下进行光照培育。
3.愈伤组织诱导：将发芽后的幼苗从培养基中取出，用无菌水
清洗。
将茎部和叶片等不同部位的组织嫁接在含有2,4-D溶液
的MS培养基上，培养在25℃下、光照下，观察诱导组织的
生长情况。
4.分离愈伤组织：当组织生长到一定大小后，用无菌操作器材
将组织用无菌剪刀分离下来。
5.愈伤组织培养：将分离出的愈伤组织放入含有NAA、BA、MS培养基中进行培养。
结果分析：
在诱导的茎部和叶片等不同部位，均出现了白色愈伤组织的诱导生长。
经过分离和培养，得到了纯化的愈伤组织。
通过显微镜观察发现，愈伤组织的细胞间隙变窄，胞间质增多，中心细胞数量增多，细胞核增大，一些细胞内的小器官也出现转化现象。
结论：
通过2,4-D溶液的诱导方法，可以在水稻幼苗的不同部位诱导出白色愈伤组织，愈伤组织的分离和培养也取得了成功。
实验结果为后续的基因转化、基因工程等实验提供了基础。
水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究
水稻愈伤组织液体增殖培养的初步研究近年来，随着科学技术的发展，水稻已经成为全球粮食的主要来源之一。
在水稻研究中，伤口愈合是最重要的课题。
鉴于此，本文旨在通过概述当前水稻愈伤组织液体增殖培养的研究进展，提出水稻愈伤组织对于研究和改良水稻品种具有重要意义。
一、水稻愈伤分化特点及愈伤组织液体增殖特性水稻愈伤特点指的是水稻愈伤的生物学特征。
水稻愈伤分化通常分为三个阶段：初期愈合阶段、肿胀期和成熟期。
在初期愈合阶段，整个植株会出现大量的细胞分裂现象，导致细胞的增殖。
当伤口进入肿胀期时，细胞会开始重新形成组织，包括基质和细胞间蛋白等。
最后，细胞将开始凝固，并形成重建组织，从而形成伤口终末状态。
水稻愈伤组织液体增殖是指当水稻愈伤组织放入混合培养液中，细胞会在混合液中迅速增殖，形成一层粘性的固定生物膜(BFAM)，并迅速形成一个完整的植株体。
二、水稻愈伤组织液体增殖技术水稻愈伤组织液体增殖的技术在近些年来发展迅速，基本上可以分为三种技术：液体培养法、水稻愈伤组织培养管理技术和利用薄层液体培养技术改良水稻品种。
首先，液体培养法是指将植物细胞悬浮液放入混合液中，然后将植物细胞分散悬浮，利用液体培养的方法进行培养。
在液体培养的过程中，植物细胞会在适宜的环境条件下快速增殖，从而获得更多的细胞。
其次，水稻愈伤组织培养管理技术是指在研究室里，将水稻愈伤组织放入培养基中，然后在贴膜室内，调整贴膜室环境温度，湿度等参数，提供最佳气候条件，以促进水稻愈伤组织的增殖，进而改良水稻品种。
最后，利用薄层液体培养技术改良水稻品种是指将调配好的培养液放入培养皿中，在适宜的环境条件下，利用薄层液体培养技术，通过不断培养，改良水稻品种，使育种更容易实现。
三、结论水稻愈伤组织液体增殖培养是目前研究水稻愈伤特性的有效技术之一，可以用来改良水稻品种。
伴随着相关技术的不断发展，水稻愈伤组织液体增殖培养技术将成为促进水稻品种改良的重要手段。
实验用组培和转化方案
本实验室用的水稻遗传转化程序1．愈伤组织的诱导：去壳的水稻种子，经70%乙醇浸润30秒后，灭菌水洗涤1次，然后用1%次氯酸钠溶液消毒20min,灭菌蒸馏水洗涤4次，无菌滤纸吸干多余水分后，将种子置于愈伤组织诱导培养基上，28 ℃黑暗下培养。
经常检查污染情况，3-4周后诱导愈伤出现。
诱导培养基配方如下:大量N6B5 微量B5 有机B5 铁盐脯氨酸 2g/L水解酪蛋白 300mg/L2,4-D 2.5 g/L蔗糖 30 g/L2．愈伤组织的继代：当胚性愈伤组织从种子盾片处生长出来后，选择颜色鲜黄，质地致密的直径1-2mm的球型愈伤组织，置于愈伤组织培养基2上，28℃、黑暗下继代培养，每4周继代一次(NB培养基)；不要用继代5次以上的材料做转化材料2,4-D和L-脯氨酸的浓度分别调整为2mg/L和0.5g/L)继代培养基配方如下大量N6B5 微量B5 有机B5 铁盐水解酪蛋白 300 mg/L脯氨酸0.5 g/L2,4-D 2 g/L蔗糖 30 g/L3．农杆菌的转化：(1)取生长健壮的愈伤组织转入新的NB培养皿中（25-30个/皿）(2)第3天，将经活化的农杆菌于液体培养基中，28˚C、200r/min培养至OD600=0.6左右，离心收集细菌重悬于等体积的NB培养基中，加入终浓度为100umo1/L的乙酰丁香酮，作为侵染液。
(3)收集生长旺盛、状态良好的直径2-3mm的愈伤组织，放于上述侵染液中，l00r/min振荡培养20min，静置10min后取出愈伤组织，无菌滤纸吸去多余菌液，(4)选取生长良好的胚性愈伤组织然后置共培养培养基共培养的培养基:N大量6B5 微量B5 有机B5 铁盐水解酪蛋白 300 mg/L脯氨酸500 m g/L2,4-D 2 g/L蔗糖 30 g/L2Omg/L 乙酰丁香酮，pH5.2。
4．抗性筛选：共培养后，用无菌滤纸吸干多余水分后，将愈伤组织转移到选择培养基上，28、黑暗下选择培养，培养时间3-4周。
水稻基因转化
2.9水稻基因转化通过农杆菌介导法转化水稻主要参考前人报道的方法2.9.1水稻成熟胚培养诱导愈伤去壳的水稻种子先用70％酒精(加一到两滴Tween 100)进行表面消毒3 min后，5％的次氯酸钠浸泡30 min，无菌水冲洗3-4次点播于NB培养基上诱导愈伤组织。
20 d左右从成熟胚盾片处挑选色泽淡黄且致密的愈伤组织继代，以后每两周继代一次。
2.9.2农杆菌对水稻愈伤组织的侵染(1)在含有抗生素的YEB液体培养基中接菌，28℃，150 rpm培养2-3 d。
(2)于4℃,5000 rpm离心3 min，去上清；重悬于AAM培养基(含0.1 mmol/L乙酰丁香酮，AS)中，28℃避光震荡培养1-2 h，至OD600=0.4左右。
(3)选择生长状态良好的的颗粒状的愈伤组织浸入农杆菌培养液中，150 rpm，震荡培养20 min后，取出并用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于共培养基上培养。
2.9.3抗性愈伤组织的筛选侵染后的水稻愈伤组织于NB共培养基上培养2-3天后，转至含1 50 mg/L G41 8以及500mg/L头孢霉素的NB培养基上筛选3周(一筛)，然后将愈伤组织转入二筛培养基(含200 mg/L G418及200 mg/L头孢霉素的NB培养基)上筛选3周，随后将抗性愈伤组织转入分化培养基(含200 mg/L G418)上(16 h光照/d)进行分化，再生植株在含有200 mg/LG418的1/2 MS培养基壮苗培养基上生根后，经2-4天炼苗后移至试验田，同时取叶片提取DNA进行转基因验证。
培养基及溶液培养基：LB 液体培养基：150mL 蒸馏水中加入胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，用5mol/L NaOH 调pH 值至7.0，用量筒定容至200mL。
LB 固体培养基：LB 液体培养基200mL +琼脂粉1.5g。
YEP 培养基：90mL 蒸馏水中加入胰蛋白胨1g，酵母提取物1g，NaCl 0.5g，用5mol/L NaOH 调pH 值至7.0，用量筒定容至100mL。
水稻愈伤组织的诱导及应用[文献综述]
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毕业论文文献综述生物工程水稻愈伤组织的诱导及应用一、前言部分1.1 关于水稻愈伤组织的简介水稻是人们重要的食粮之一，由于其基因组小，通过组织培养易获得再生植株等特点而在基因克隆、基因功能验证以及遗传转化等研究方面成为模式植物．生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞培养是获得转基因植物的最好来源．因此，建立一个高效再生体系是实现基因转化的先决条件[1]．近年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株．虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐被广泛用于水稻的遗传转化、品种培育中[2-3]．但上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展．1.2 组织培养所谓的植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基对离体的植物器官组织细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术[4]。
其研究的类型主要包括组织培养、器官培养、细胞培养、及原生质体培养。
随着研究T作的深入进展，上述5个方面的研究理论和技术体系逐渐得到完善促使植物组织培养的应用范围日益广阔延伸。
组织培养作为一种育种技术在水稻等重要粮食作物已广泛应用，并培育出一大批优良品种，自1965年我国开展水稻细胞培养研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。
再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。
远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。
采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。
植物的快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立
农杆菌EHA105转化条件的优化及水稻愈伤组织遗传转化体系的初步建立：以质粒PBI121和gfp作为外源DNA转化农杆菌EHA105，通过对EHA105生长状态的测定，并对重悬液Cacl浓度，速冻时间和热处理温度等实验条件逐一进行筛2选，以确定EHA105的最优转化条件。
然后，分别用被转化的农杆菌侵染水稻愈伤组织。
结果表明，农杆菌 OD值接近0.6经过20mmol/L Cacl2重悬细胞，液氮速冻5600分钟后于28?处理5分钟，农杆菌的转化效率最高。
愈伤组织经GUS染色或荧光观察，外源基因已经转入水稻种子中。
农杆菌；水稻愈伤组织；遗传转化: Agrobacterium tumefaciens EHA105 was transformed by the plasmid PBI121 and gfp. To difine the best experimental conditions for transformationof A.tumefaciens the growth rate of the A.tumefaciens EHA105 was measured ,andthe concentration of resuspension solution,freezing time and the thawingtemperature were tested. And then infected mature rice in order to inducecallus with Agrobacterium tumefaciens respective .Result: By resuspended inCaclbuffer, frozen in liquid nitrogen for 5 min and thawed in 28? for 5 2min, the efficiency of transformation was the best. The callus was dyed byGUS or seen by fluorescence, which can testify that exterior gene has beentransferred into rice.Agrobacterium tumefaciens; rice callus; Genetic transformation水稻是世界上重要的粮食作物，并已为分子生物学研究的模式作物之一。
水稻转化方法
水稻转化方法配置1升诱导培养基：1.水解酪蛋白300 mg/L2.谷氨酰胺500 mg/L3.脯氨酸500 mg/L4.肌醇100 mg/L5.蔗糖30g/L6.PHytagel 2.6 mg/LN6大量50毫升，B5微量5毫升，B5维生素5毫升，铁盐毫升，2,4-D母液2毫升，pH 5.85.1水稻转化受体的准备5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟，进行表面灭菌。
(灭菌时要经常搅拌)用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。
在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。
约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。
以后每两周继代培养一次。
挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。
成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点（病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）注意：粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2农杆菌的培养将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线，28℃黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为CM液体培养基中，调整菌体浓度至OD600100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
水稻愈伤分化和再生研究进展
摘
要： 水稻 是 我 国 最 重 要 的 粮 食 作 物 ， 维持 着超 过 半 数 人 １ ： ７
高 。 自从 １ ９ ６ ５年 ， Ａｍｅ ｍｉ ｙ ａ等开始 水 稻 组织 培 养 ， 几十 年来 ， 各 国研究 者 先 后从 水 稻 各 部 位诱 导 出愈 伤
组 织 和再 生 植 株 ＿ ４ ］ 。 同 时发 明 了多 种 转 化 技 术 和 方
有周期 短 、 适 用对 象 广 等 特 点 。 由于 粳 稻 品种 愈 伤 分 化 和植 株再 生率 较 高 ， 转 基 因育 种 在 粳 稻 中 已取 得 了 可 喜 的成 果 ， 但 是 占整 个 水 稻 品 种 的 ８ Ｏ 以上 的 籼 稻
（ １ ９ ９ ６ ） 利 用 农 杆 菌介 导 法 获 得 了转 基 因 的爪 哇 稻 植
本 文 主要从影 响水 稻愈 伤分 化和 再生 因素 以及 调控 基 因等方 面 的研 究进 行综 述 。
ｌ 水 稻 遗 传 转 化
水稻 遗传 转化 采用 最多 的体 系为愈 伤组 织再 生 系 统， 水稻 体细 胞组织 培 养 作 为水 稻 基 因工 程 的基 础技 术， 在水稻 遗传 改 良中具 有 重 要 的作 用 。利 用愈 伤组
的 生存 。 转基 因技 术 是 水 稻 产 量 提 高 和 质 量 提 升 的 一 个 重 要 工具。然而 ， 籼 稻 中 大 多数 品 种 由 于愈 伤 诱 导 困难 以 及 分 化 率
低， 限制 了转 基 因技 术 在 籼 稻 中的 应 用 。 本 文 综 述 了基 因 型 、
外植 体 来 源 、 培 养 基 和 外 源 激 素 对 籼 稻 愈 伤 诱 导 和 分 化 的 影
要方 法之 一［ ＿ ８ ＿ 。
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水稻愈伤组织转化一、实验目的1.掌握植物组织培养的基本原理；2.学习水稻愈伤组织的诱导方法；3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法；4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。
二、实验原理1.植物组织培养植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技术。
自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。
用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。
根据外植体的类型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。
（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。
）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。
2.基因工程基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。
这种利用基因工程技术获得的植物一般称为“基因工程植物”。
自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速，成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。
通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。
3.农杆菌转化法转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。
农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：T-DNA（Transferre DNA）区：农杆菌Ti 质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分。
T-DNA区大小为10-30Kb，左右边界高度保守，为25bp正向重复序列。
根癌农杆菌进行转化时，只识别左右边界（尤其是右边界在转化时最为重要），而T-DNA区内为什么基因则不影响转化。
因此我们可以通过基因工程改造T-DNA区，转化目的基因。
毒性蛋白（Virulence）区：越20Kb，包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有些基因区含多个基因，形成操纵子结构。
毒性蛋白区在侵染植物细胞的过程中起重要作用。
4.农杆菌转化过程：1)植物受伤部位酚类化合物的分泌；2)附着（染色体毒性基因ChvA、ChvB）；3)VirA/G的双元系统感受受伤信号；4)其他 Vir基因的表达；5)T-DNA链的切出（VirD1+VirD2）；6)T-complex（T复合体）的形成；7)运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核）；8)整合。
植物受伤后的分泌物中含有酚类物质，这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性迁移至植物受伤部位，在ChvA、ChvB的帮助下，附着到受伤部位。
【因此在人工进行农杆菌侵染时，需要加入乙酰丁香酮（AS）吸引农杆菌，乙酰丁香酮即起到和植物受伤后分泌的酚类物质相同的作用。
】VirA识别植物受伤后分泌的酚类物质信号，进行自磷酸化，进而将磷酸化信号传VirG——这是典型的细菌双元信号传导系统。
VirG磷酸化后被活化，作为转录因子启动或增强各毒性蛋白的表达。
VirD2在 D1的帮助下识别T-DNA区25bp的边界序列，利用核酸外切酶的在第3、4碱基之间形成缺刻；VirD2的Tyr29与缺刻的5 ’端共价结合，DNA新链合成时便生成一条T-DNA单链，这条单链与VirD2和VirE2 结合形成T-complex。
T-complex通过细菌细胞壁上由11个VirB 蛋白和VirD4组成的通道从农杆菌进入植物细胞。
此外，VirD2含有NLS（核定位序列），能够引导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植物染色体中。
VirE2是非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA由随机卷曲状态转变为规则螺旋，这种形状使T-complex 容易穿过核孔。
此外，VirE2将T-DNA包裹，还可避免T-DNA从细菌向植物转移过程中被降解。
VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex进入植物细胞；VirE2虽不含NLS序列，但亦可促进T-complex向核定向转运。
5.Ti质粒的改造：Ti质粒只有被解甲之后才能被应用于转基因实验中。
所谓解甲，是指去除对转基因有不良影响的基因，如生长素、细胞分裂素合成基因等。
现使用的工程菌株均使用双元载体。
双元载体由存在于工程菌株中的大质粒和方便体外操作的小质粒组成。
大质粒包含Vir区，负责侵染植物细胞、帮助T-complex转运等；小质粒约十几Kb，方便体外操作，包含T-DNA区、筛选标记等。
实际应用时，将目的基因插入T-DNA区即可。
三、实验用品1、实验仪器：镊子、灭菌滤纸、移液器、平皿、离心管、离心机、三角瓶、EP管、摇床、分光光度计、超净工作台等；2、实验材料：日本晴水稻种子、 EHA105农杆菌；3、实验试剂1)0.1% 升汞，无菌水等2)抗生素：利福平（Rif）、卡那霉素（Kan）、头孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）3)培养基：①N6培养基：② YEP 培养基③ 侵染培养基：N6D2（N6加2mg/L 2,4-D ）液体培养基+AS （100μM ） ④ 共培养培养基：N6D2+AS （100μM ）固体培养基⑤ 筛选培养基1（初次筛选）：N6D2+Cef （600mg/L ）+Hyg （25mg/L ）固体培养基 ⑥ 筛选培养基2（二次筛选）：N6D2+Cef （300mg/L ）+Hyg （50mg/L ）固体培养基 ⑦ 分化培养基：N6+6-BA+NAA+Cef （300mg/L ）+Hyg （50mg/L ）固体培养基四、实验步骤（一）水稻愈伤组织的诱导：1. 水稻种子去壳，0.1%升汞消毒2. 滤纸吸干水分，将种子置于 N 6D2固体培养基上 25℃暗培养诱导愈伤组织；一周时去除长出的芽；3. 愈伤组织长至较大时（约 2周）继代，培养至 7天用于转化。
（二）农杆菌活化4. 早上取甘油保存的农杆菌，加至 3-5 ml YEP 液体培养基中（含利福平 R if25mg/l 和卡那霉素K an 50mg/l ），28℃培养至晚上； 5. 农杆菌培养物，按 200至 500倍左右稀释，加入不含抗生素的 Y EP 液体中，28℃过夜培养； 6. 测量 O D600，培养至 0.5左右；（三）农杆菌浸染及共培养7. 将农杆菌培养物转移至灭菌离心管中，管壁标记液面位置，离心收集菌体；8. 弃上清，倒置离心管，流尽剩余的 Y EP ；9. 加入含 100μM 乙酰丁香酮 （AS ）的 N 6D2 液体培养基至标记位置，彻底重悬菌体（可先加入少量 N 6D2，重悬后将剩余的加入）； 10. 静置 2h ，期间收集待转化愈伤组织；11. 将愈伤组织加入农杆菌悬液中，晃匀，静置 30 min ；12. 倒掉多余液体，愈伤组织转到灭菌滤纸上，超净台吹 15～20 min ；13. 将愈伤组织转到含 100μM 乙酰丁香酮 N 6D2固体培养基上，培养基上垫 一层灭菌滤纸； 14. 黑暗中 25℃度共培养 3天；（四）筛选15. 用含 300mg/L 头孢霉素的无菌水冲洗愈伤组织 3-5 次，每次 10min ，不断摇 晃；洗至液体澄清（约需 4-5次）； 16. 用灭菌滤纸吸干多余愈伤组织转到含 600 mg/l 头孢霉素 C ef 和 25 mg/l 潮霉素 H yg 的 N 6D2 固体培养基（筛选培养基Ⅰ）上，筛选 2周（可缩短至 10天），期间注意去除有农杆菌增殖的愈伤组织块； 17. 愈伤组织转到含 300 mg/l 头孢霉素 （Cef ）和 50 mg/l 潮霉素（Hyg ）的 N 6D2固体培养基（筛选培养基Ⅱ）上，筛选2周；（五）植株再生18. 将筛选获得的 H yg 抗性愈伤组织转移到含 3mg/l 6-BA 和 0.5 mg/l NAA 的 N6 培养基（不含 2,4-D ）,2（以下步骤未进行） 19. 将含绿点或小植株的愈20. 2-4 周后，将茁壮的再生植株移出，室内水培壮苗2-3 天后，移栽至土中， 苗期水刚好没过土即可。
（六）鉴定21. GUS 染色：在生长状态良好的克隆上夹取少量愈伤组织，放入EP 管中，加入少量X-Gluc 染液至没过材料，37℃过夜染色；（以下步骤未进行）22.PCR检测：过程略。
五、实验结果1.愈伤组织诱导2.二次筛选平板（色泽浅而鲜艳的愈伤为阳性）。
从二次筛选的结果看，转化率在60%左右。
这些克隆在后续实验中大多可以继续生长愈伤，但随机选取4个克隆进行GUS染色均为阴性。
实际的转化率，应小于二次筛选的统计。
3.愈伤组织的再分化（已可见绿点，是再分化的标志，会长成芽）4.GUS染色鉴定（有愈伤组织被染成蓝色，证明是阳性克隆）六、结果分析及总结总体来说，整个实验下来，我们基本掌握了水稻组织培养、转基因及鉴定的方法。
整个过程是曲折的，我们走了很多弯路。
或许一学期刚刚做到再生植株是挺慢的，但整个实验在徐老师的指导下，都是由我们自己独立完成的，得与失都是我们实验的经历——这些远比最后的结果更有价值。
首先，无菌意识是我在整个试验中时刻不敢松懈的。
组培的前提是无菌操作，它保证了整个实验的顺利进行。
在第一次诱导愈伤的时候，大家的污染情况十分严重，有的组甚至是全军覆没。
但是到了实验后期，材料染菌的情况就只是零星出现了，这使我们大家都十分欣喜。
第二是培养基的问题。
培养基也是组培的基础，但是它的问题有时是不容易确定的。
在1L培养基中多加或是少加了1g蔗糖，究竟有没有影响？是好还是坏的影响？我也无法回答。
但是我们不能存有侥幸心理，而必须严格每一步的操作。
不仅是试剂的称量，也包括试剂的溶解、添加的顺序、pH的调节等问题。
当一批材料出现普遍性的问题时，我们就需要考虑培养基的问题，是需要改良培养基还是培养基在配置中出现问题。
这个实验中的N6培养基是早已被验证过的，我们第一批材料愈伤诱导率低，应该是培养基配的不够好。
在更换商业化的N6粉末后，问题得到了显著改善。
第三点，我认为应该重视实验材料。
只有对实验材料的认识足够清晰，才能有针对性的做好每一步实验。
一开始种子的选择，要选取饱满的种子，剥壳时注意不要损伤到胚。
在之后多次培养中，要清楚是光下培养还是暗培养。
培养温度也是重要的条件，温度的小幅度变化可能不会决定实验的成败，但会影响实验的时间及材料的生长状况。