Agilent1260+ 6460分析硝基呋喃代谢物的LCMS方法
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质联用法进行测定。我国目前有多项有关硝基 呋喃残留量测定的国家和行业标准。
Page 4
1： GBT 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效 液相色谱 串联质谱法
2： GBT 20752-2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量
的测定 液相色谱-串联质谱法 3： 农业部781号公告-4-2006 动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定高效液
AOZ
H 2N N
2-NB-AOZ
O
N
0.1M HCl, 37o, 16 hr
NO
2
N N N O O O
AMOZ
O N
O O O
2-NB-AMOZ
O
NO 2 N NH2
AHD
HN
N O
N NH O H N NH 2 O
2-NB-AHD
NO 2
O
SEM
H 2N
N N H NH 2
2-NB-SEM
代谢物不能保留在反相SPE上
Page 19
注意事项
1、取样要具有代表性、并且防止被分析物的变化和污染，制备好样品后尽快进 行检测；
2、样品前处理过程中尽可能避免光，防止破坏代谢衍生物；
3、衍生完成后，调节pH在7.4左右； 4、最好采用同位素内标法定量分析； 5、标准品避光低温保存； 6、注意含有面粉制品的动物源食品可能会出现呋喃西林（SEM）假阳性结果； 7、考虑测定总含量（Total）还是结合态含量（Bound）的硝基呋喃； 8、尽量采用硝基呋喃代谢物直接衍生测试，不推荐购买使用已衍生的标准品；
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TIC of 0.1ng/mL Nitrofurons
AMOZ
SEM
AOZ
AHD
Page 14
MRM of 0.1ng/mL Nitrofurons
Page 15
Sencitivity of SEM
SEM 0.1ng/mL S/N=32.2 (Peak to Peak) 进样量为15µL
Page 12
MRM Conditions
化合物 Compound AMOZ D5-AMOZ SEM 母离子 Precursor Ion 335.2 340.2 209 192 C13-SEM 212 168 104 AHD 249 134a C13-AHD 252 134 104 AOZ 236 134a D4-AOZ 240 134 30 30 90 100 7 7 30 30 30 100 90 90 6 7 17 30 30 30 90 90 100 6 5 18 子离子 Product Ion 262 291.2a 296.3 166a 驻留时间 Dwell Time 30 30 30 30 提取电压 Fragmentor 110 110 100 90 碰撞能量 Collision. Energy 12 6 6 9
Page 16
Sencitivity of AHD
AHD 0.1ng/mL S/N=19.8 (Peak to Peak) 进样量of 0.1ng/mL Nitrofurons (n=4)
Page 18
Calibration curve of Nitrofurons
20 20
Page 11
MS Parameters
◆ MS system : Agilent 6460 LC/MS/MS
◆ Ion source
◆ Polarity ◆ Source Temp ◆ Gas Flow ◆ Nebulizer ◆ Sheath Gas Temp ◆ Sheath Gas Flow
衍生物可以保留在 反相SPE上
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检测流程图
1提取
2g样品 +100μL内标物（20ng/mL） +10mL 0.2M HCl +100μL 100mM 2-NBA
混合，震荡5-10min，37℃恒温水浴衍生过夜（14-16h）
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2净化
冷却至室温 +1mL 0.3M Na3PO4 +2M NaOH调 pH 7.4 ± 0.2 +5mL乙酸乙酯×2 振荡10-20min，4000r/min离心5min 乙酸乙酯层 40℃下，N2吹干 +1mL流动相定容 +2×2mL正己烷（乙腈饱和） 水层（弃去）
定容，正己烷净化除脂，高效液相色谱/串联质
谱测定，内标法定量。
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EU，美国，日本，中国等大多数国家禁止使用于动物食品 在生理基质中很少发现抗生素原药形式
代谢产物与组织中的蛋白结合
呋喃它酮 (原药)
O N H2N O
AMOZ (代谢物)
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O
OHC NO 2 NH2
NO 2 N N O O
9、流动相中最好添加2-5mM乙酸铵或甲酸铵；
10、定期更换样品处理的聚四氟乙烯管； ……
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相色谱－串联质谱法
4： SNT 2061-2008 进出口蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱 质谱法
5： SNT 1627-2005 进出口动物源食品中硝基呋喃类代
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方法原理：
用盐酸水解样品中的蛋白结合态硝基呋喃代谢
物，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调节pH值至中性
后，用乙酸乙酯提取，浓缩吹干后，用流动相
水层
正己烷层（弃去）
过0.20μm滤膜，上LC/MS/MS测定
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LC Parameters
◆ ◆ ◆
LC system
: Agilent 1200 RRLC
Column
Injection Volumn Flow rate Mobile phase Gradient
: Agilent Zorbax Plus- C18, 2.1× 100mm, 1.8µ m
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针对硝基呋喃的潜在危害性，世界许多国家 都禁止在食用性动物中使用硝基呋喃。欧盟、 美国等国家均在法规中规定硝基呋喃残留限 量标准为“零允许量”（Zero tolerance）， 即不得检出。农业部在2002年4月禁止其在食
用性动物中的食用。
Page 3
方法研究
硝基呋喃残留量分析方法国内外主要采用液
动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留 量检测方法 LC-MS/MS
Agilent Technologies
2010.09
背景资料
硝基呋喃类兽药主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、 呋喃西林、呋喃妥因等。通过食品摄入超量硝基呋 喃类残留后，对人体造成的危害主要是胃肠反应和 超敏反应。剂量过大或肾功能不全者，可引起严重 毒性反应，主要表现为周围神经炎、嗜酸性白细胞 增多、溶血性贫血等。长期摄人可引起不可逆性末 端神经损害，如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等。
: ESI
: Postive : 325℃ : 6 L/min : 45 psi : 400 ℃ : 12 L/min
◆ Capillary
◆ Resolution ◆ Scan mode
: 4500V
: Q1 (wide) Q3 (unit) : Multiple Reaction Monitoring (MRM)
: 20 µ L : 40 ℃ : 0.4 mL/min : A-H2O(2mM Ammnium acetate+0.1%FA) : B-Acetonitrile :
◆ Temp ◆ ◆
◆
Time 0.0 4.0 4.5 6.0
A% 80
B% 20
60
10 10
40
90 90
6.1
10.0
80 80
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1： GBT 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效 液相色谱 串联质谱法
2： GBT 20752-2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量
的测定 液相色谱-串联质谱法 3： 农业部781号公告-4-2006 动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定高效液
AOZ
H 2N N
2-NB-AOZ
O
N
0.1M HCl, 37o, 16 hr
NO
2
N N N O O O
AMOZ
O N
O O O
2-NB-AMOZ
O
NO 2 N NH2
AHD
HN
N O
N NH O H N NH 2 O
2-NB-AHD
NO 2
O
SEM
H 2N
N N H NH 2
2-NB-SEM
代谢物不能保留在反相SPE上
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注意事项
1、取样要具有代表性、并且防止被分析物的变化和污染，制备好样品后尽快进 行检测；
2、样品前处理过程中尽可能避免光，防止破坏代谢衍生物；
3、衍生完成后，调节pH在7.4左右； 4、最好采用同位素内标法定量分析； 5、标准品避光低温保存； 6、注意含有面粉制品的动物源食品可能会出现呋喃西林（SEM）假阳性结果； 7、考虑测定总含量（Total）还是结合态含量（Bound）的硝基呋喃； 8、尽量采用硝基呋喃代谢物直接衍生测试，不推荐购买使用已衍生的标准品；
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TIC of 0.1ng/mL Nitrofurons
AMOZ
SEM
AOZ
AHD
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Sencitivity of SEM
SEM 0.1ng/mL S/N=32.2 (Peak to Peak) 进样量为15µL
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MRM Conditions
化合物 Compound AMOZ D5-AMOZ SEM 母离子 Precursor Ion 335.2 340.2 209 192 C13-SEM 212 168 104 AHD 249 134a C13-AHD 252 134 104 AOZ 236 134a D4-AOZ 240 134 30 30 90 100 7 7 30 30 30 100 90 90 6 7 17 30 30 30 90 90 100 6 5 18 子离子 Product Ion 262 291.2a 296.3 166a 驻留时间 Dwell Time 30 30 30 30 提取电压 Fragmentor 110 110 100 90 碰撞能量 Collision. Energy 12 6 6 9
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Sencitivity of AHD
AHD 0.1ng/mL S/N=19.8 (Peak to Peak) 进样量of 0.1ng/mL Nitrofurons (n=4)
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Calibration curve of Nitrofurons
20 20
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MS Parameters
◆ MS system : Agilent 6460 LC/MS/MS
◆ Ion source
◆ Polarity ◆ Source Temp ◆ Gas Flow ◆ Nebulizer ◆ Sheath Gas Temp ◆ Sheath Gas Flow
衍生物可以保留在 反相SPE上
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检测流程图
1提取
2g样品 +100μL内标物（20ng/mL） +10mL 0.2M HCl +100μL 100mM 2-NBA
混合，震荡5-10min，37℃恒温水浴衍生过夜（14-16h）
Page 9
2净化
冷却至室温 +1mL 0.3M Na3PO4 +2M NaOH调 pH 7.4 ± 0.2 +5mL乙酸乙酯×2 振荡10-20min，4000r/min离心5min 乙酸乙酯层 40℃下，N2吹干 +1mL流动相定容 +2×2mL正己烷（乙腈饱和） 水层（弃去）
定容，正己烷净化除脂，高效液相色谱/串联质
谱测定，内标法定量。
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EU，美国，日本，中国等大多数国家禁止使用于动物食品 在生理基质中很少发现抗生素原药形式
代谢产物与组织中的蛋白结合
呋喃它酮 (原药)
O N H2N O
AMOZ (代谢物)
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O
OHC NO 2 NH2
NO 2 N N O O
9、流动相中最好添加2-5mM乙酸铵或甲酸铵；
10、定期更换样品处理的聚四氟乙烯管； ……
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相色谱－串联质谱法
4： SNT 2061-2008 进出口蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱 质谱法
5： SNT 1627-2005 进出口动物源食品中硝基呋喃类代
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方法原理：
用盐酸水解样品中的蛋白结合态硝基呋喃代谢
物，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调节pH值至中性
后，用乙酸乙酯提取，浓缩吹干后，用流动相
水层
正己烷层（弃去）
过0.20μm滤膜，上LC/MS/MS测定
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LC Parameters
◆ ◆ ◆
LC system
: Agilent 1200 RRLC
Column
Injection Volumn Flow rate Mobile phase Gradient
: Agilent Zorbax Plus- C18, 2.1× 100mm, 1.8µ m
Page 2
针对硝基呋喃的潜在危害性，世界许多国家 都禁止在食用性动物中使用硝基呋喃。欧盟、 美国等国家均在法规中规定硝基呋喃残留限 量标准为“零允许量”（Zero tolerance）， 即不得检出。农业部在2002年4月禁止其在食
用性动物中的食用。
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方法研究
硝基呋喃残留量分析方法国内外主要采用液
动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留 量检测方法 LC-MS/MS
Agilent Technologies
2010.09
背景资料
硝基呋喃类兽药主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、 呋喃西林、呋喃妥因等。通过食品摄入超量硝基呋 喃类残留后，对人体造成的危害主要是胃肠反应和 超敏反应。剂量过大或肾功能不全者，可引起严重 毒性反应，主要表现为周围神经炎、嗜酸性白细胞 增多、溶血性贫血等。长期摄人可引起不可逆性末 端神经损害，如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等。
: ESI
: Postive : 325℃ : 6 L/min : 45 psi : 400 ℃ : 12 L/min
◆ Capillary
◆ Resolution ◆ Scan mode
: 4500V
: Q1 (wide) Q3 (unit) : Multiple Reaction Monitoring (MRM)
: 20 µ L : 40 ℃ : 0.4 mL/min : A-H2O(2mM Ammnium acetate+0.1%FA) : B-Acetonitrile :
◆ Temp ◆ ◆
◆
Time 0.0 4.0 4.5 6.0
A% 80
B% 20
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10 10
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