生物转化常见反应类型

间歇培养法（Batch culture)
这种方法能够比较直接而简单地筛选能否具 有转化某种化合物的活性菌株。
培养 定量 一定时间 待转化物
发酵液
作用
鉴定
游离的整体细胞
• 游离的整体细胞直接作为催化剂来制造产
品的报道已经不少
• 在某种程度优于固定化细胞
• 在生物转化酶工程中越来越受到重视 • 游离整体细胞的基础研究更为重要
基因工程新技术的应用
专利： • Pseudomonas 菌株无降解甾体的能力 • 将Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA 导入Pseudomonas 菌株中获得重组菌。 • 重组菌可在水相，一种或几种有机相中进 行转化反应。 • Pseudomonas 菌株比Mycobacterium sp NRRL-3683的生长输率快 • 结果加快转化进程，降低成本。
是甾体微生物转化中最重要的反应。 化学法除了较容易在C17引入羟基外，在其 他位置都很难引入羟基。
微生物对甾体的羟基化作用
• 微生物能在甾体的任何位置进行羟基化发应， 也可在非甾类有机分子上羟基化。 • 简单的羟基化作用是在甾体的某个位置上引入 O原子。 • 在甾核上至少有21个位置可以发生。 • 11位羟基化作用最重要，11位C的氧化对可的 松药物疗效是不可缺少的，11，11。 • 除11位C进行羟基化反应外，9，14，16 的羟基化，在制备甾体药物时，生产皮质甾类 化合物及其类似物。
甾体的边链降解
侧链降解 • 微生物对甾体侧链的降解，解决了天然甾体 化合物作原料合成甾体激素的问题，为利用 原价的原料开辟了新的途径。 • 常见微生物有： • 简单节杆菌 • 球形芽孢杆菌 • 玫瑰芽孢杆菌 • 淡紫青霉 • 藤黄诺卡氏菌
• 甾体边链降解 • 甾体母核降解
3－羟基－∆5甾醇
微生物在甾体药物生产中的应用
主要分为两大类 • 将天然原料转化为生产甾体化合物的普通中间体。 如植物皂角苷羟化生成皂角苷配基 降解甾醇边链生成有用的甾体化合物中间体， 雄甾－4－烯－3，17－二酮； 雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮。 • 转化成特殊的甾体化合物的中间体，以生产我们所 需要的产物。 如：甾体11，11及16羟化， ∆1 脱氢 甾体边链降解
进行甾体羟基化作用的微生物
转化物质 作用位置 微生物代表
黑根霉、黑曲霉、腊状杆菌等
弯曲孢霉 黑根霉、黑曲霉、焦曲霉构巢曲 霉 假单孢杆菌、弗氏链霉菌、梨头 霉
孕酮
化合物S
11 11
11 11 11
11脱氧皮脂酮
弯月弯孢霉
雌二醇
16
巨大芽孢杆菌
羟基化反应机理
羟基化反应
由于这些酶能将一摩尔分子氧引入底物，因 此被定义位单氧化酶。 这种细胞色素p450依赖的单氧化酶存在于几 乎所有形式的生命体中，以游离或膜结合的 形式存在。
环糊精作用
• 环糊精有利于提高甾体底物溶解度
• 真菌能以环糊精作为C源
其他重要的羟基化反应
• 地索高诺酮（destogestrel） 新型避孕药（荷兰 Organon公司推出） • 作用：月经周期控制好，副作用少，避孕可靠 • 我国研究：上海医科大学史纪平 • 19－去甲基－13－乙基雄甾－4－烯－3，17－双 酮―――11羟基化（金龟子绿僵菌）形成关键 中间体 • 简化合成路线，降低副反应。 • 底物：0.2% 转化率：36％
关系
培养基
培养方法
不同底物浓度的反应速率 • 底物质量浓度较高时，在某一时间（8h） 前，转化速率较低，而后，反应速度加快。 对底物富马酸盐的转化彻底。（99.2％） • 底物浓度较低时，反应速度始终较慢 对底物富马酸盐的转化不彻底。（63％） 特点： • 高质量底物浓度有较高的反应速率 • 高质量浓度底物有较高的转化率 • 催化反应一般有个迟滞期
选择性甾体边链降解措施2
• 加入酶抑制剂，抑制母核降解关键酶如：C 1，2脱 氢酶和9羟化酶。 如： Ni Co Pb Se 8－羟基喹啉应用于多种分枝杆菌对胆固醇的选 性边链降解 金属鳌合剂 2，2－双联吡啶 抑制母核降解
选择性甾体边链降解措施3
• 对菌株进行诱变，产生仅降解甾醇侧链的突变株 例如： • 原始菌株经诱变为 诱变菌株Mycobacterium sp，NRRL-B3683 不加抑制剂，便产生雄甾－1，4－二烯－3，17 －二酮（ADD） • 再诱变得Mycobacterium sp，NRRL-B3805， 无C 1，2脱氢酶 能产生雄甾－4－烯－3，17－二酮（AD）
方法
• 分离纯化Mycobacterium sp NRRL-3683 的DNA • 整合到特定质粒载体中 • 导入噬菌体中 • 用入噬菌体感染E.coli HB101，得E.coli 重组子 • 三亲杂交实现Mycobacterium sp NRRL3683 的DNA到Pseudomonas 菌株得转移。
如何提高甾体边链降解的产率
接触
提高甾体边链降解速率
• Hesselink等研究表明：环糊精能明显增强 Mycobacterium sp NRRL-3683 降解胆固 醇、谷甾醇等边链生成AD的产率，不影响 细胞生长速度和细胞密度。 • 当环糊精：底物浓度=2:1时，微生物降解 边链的活性可增加1.7-3.0倍。 • 环糊精能阻止母核的降解及产物的反馈抑 制。
环糊精的应用实例2 • GD：19－去甲基－13－乙基雄甾－4 －烯－3，17－双酮 • 经Penicillium raistrickii进行15羟 基化――――口服避孕药∆5－D－十 八甲基炔诺酮（gestodene）的重要 中间体。 • Schlosser等研究表明：在－环糊精 存在时，菌株或其固定化细胞对CD的 15羟基化作用，与以甲醇做溶剂比较， 其转化率都能明显提高。
其他的甾体生物转化反应类型
• 脱氢作用
• A环芳香
脱氢作用－使甾体核形成双键 强的松（去氢可的松） 是可的松经脱氢而形成的。 其抗炎功效比可的松高几倍。一般制备 该种药物时，常常是将可的松或氢化可 的松脱氢变为去氢可的松或去氢氢化可 的松。
脱氢反应的常见微生物为
简单节杆菌 各种芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢 杆菌） 镰刀霉 长蠕孢菌属。
A环芳香化
所谓A环芳香化 是指甾体A环核上的每个C原子都脱氢形 成双键，而变为芳香化结构。 雌性激素的生产（雌二醇），可通过此 方法获得
研究生物转化的几种常用方法
第四章 研究生物转化的几种常用方法
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间歇培养法 整体细胞转化法 洗涤均丝悬浮法（静息细胞法） 孢子转化法 原生质体实验法 遗传特性诱变法 同位素示踪法
环糊精在甾体边链降解中的 作用总结 • 在甾体边链降解过程中，环糊精充当： • 惰性甾体增溶剂 • 反应载体 • 保护剂
甾体边链降的成功应用
Arhna 和Sih等研究报道以胆甾醇和－谷甾醇为原料 微生物转化法合成甾体药物中间体的方法。 • 采用酶抑制剂 • 生化阻断变株 • 改变细胞膜通透性等生物技术改造甾醇的结构，从而 选择性控制甾醇的边链降解 成功合成中间体 雄甾－4－烯－3，17－二酮（4－ AD） 雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮（ADD） 9羟基－4－AD 目的：工业生产性激素，利尿剂等甾体药物
阶段转化的影响，常常用洗涤的静息细胞来代替 发酵液中的生长的细胞，即将不同生长阶段的细 胞取出，洗去沾染的原培养液及其代谢产物，然 后把细胞悬浮在人工转化系统内，在一定条件 下
进行生物转化。
孢子转化法
真菌的分生孢子和子囊孢子，往往含有的酶 活力高，且常常用于生物转化。 细菌的内生孢子（芽孢），一般无转化活性。
甾体化合物结构
菲
环戊烷多氢菲
甾体化合物编号
17
12 11 1 2 3 4 9 13 14 8 7 6
16
15
10
5
环戊烷多氢菲
甾类化合物常见种类 动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、 皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等 睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激 素。 植物中：薯芋皂豆甾醇
酵母细胞：麦角固醇
第三章 介绍生物转化的常见反应类型
以甾体化合物的生物转化为例进行阐述 • 甾体化合物和甾体药物简介 甾体化合物结构 甾类化合物常见种类
甾体化合物和甾体药物简介
• 1952年，美国普强药厂的Morray和 Pereroon首次利用黑根霉将黄体同转化为 11黄体酮，人们开始认识到甾体微生物转 化在甾体药物生产中的重要性。 • 微生物几乎对甾体的每个位置都能进行转 化。 • 几种重要的甾体微生物转化发应如羟化， 脱氢成为工业上生产甾体激素及其类似物 的重要手段
酶细胞在生物转化中的形态变化
低底物浓度扫描观察
酶细胞在生物转化中的形态变化
高底物浓度扫描观察
形态学变化
• 高质量底物浓度下细胞发生明显的形态学
变化 • • 细胞表面发上皱褶，有明显的凹陷 细胞膜变薄，松弛、不明显，内部结构
变松，不致密。
高质量浓度底物对含酶细胞的渗透化作用
静息细胞法
为了排除原培养基中自身的代谢产物对不同生长
甾体化合物
• 一类含有环戊烷多菲核的化合物 • 在甾核的第10，13位常常含有角甲基；在3， 11,17位，可能有羟基、酮基；A，B环有部 分双键；17位有不同的测链。
目前甾体微生物转化中受到人们广泛关注的领域
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将微生物基因工程的新技术应用于甾体微 生物转化 提高水不容性底物的溶解度 细胞和酶的固定化以利于酶的重复经济利 用 发展经济有效的产物连续回收方式 将环糊精等应用于培养基以提高产量
游离整体细胞的基础研究内容
• 细胞的渗透化
• 酶的胞内固定化
• 酶细胞在反应前后的形态变化和结构变化
整体细胞转化应用举例
• 底物：富马酸 • 产物L－天冬氨酸 • 生物转化酶：天冬氨酸酶（EC4.3.1.1）
• 转化菌株：E.coli
整体细胞转化研究
细胞形态与结构
底物浓度
催化反应速度 细胞的渗透性
甾体化合物编号
17
12 11 1 2 3 4 9 13 14 8 7 6
16
15
10
5
环戊烷多氢菲
Байду номын сангаас
甾类化合物常见种类 动物组织中：胆固醇、胆酸、皮脂素、 皮脂醇（氢化可的松）、皮脂酮等 睾酮、雄酮、孕酮、雌二醇等生殖腺激 素。 植物中：薯芋皂豆甾醇
酵母细胞：麦角固醇
甾体类激素药
• 肾上腺皮脂激素类 可的松、强的松、氢化可的松 功能：抗炎、抗毒、抗过敏 对风湿、类风湿性关节炎、红斑狼疮等有治疗 作用。 • 生殖腺激素 孕酮、雌酮 功能：调节内分泌 • 人工合成避孕药 长效孕酮等
氧化
3－酮－∆4化合物 微生物种类不同 9羟基化，∆1，2脱氢 ∆1，2脱氢，9羟基化
甾体边链降解
• 采用类似脂肪酸氧化的氧化过程，最后形 成C17酮甾体。
选择性边链降解问题
• 选择性边链降解策略（3） 辅助基因工程 • 提高边链降解的产率策略
选择性甾体边链降解措施1
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对甾醇进行结构改造，从而阻止酶对母核的降 解 例如：1965 Sih等 将胆固醇先行改造为19羟基 衍生物 再经一步微生物转化为A环芳香化的雌酚酮。
微生物对甾体化合物的转化
• 微生物对甾体化合物的转化多种多样 • 它们对甾体的每一位置上的原子或基团都有可能 进行生物转化。 • 其反应类型主要有氧化、还原、水解、酯化等等。 • 包括甾体母核上和测链上的某个位置的羟基化、 酮基化、环氧化、脱氢形成双链、芳香化、开环、 形成内酯、侧链断裂、降解。
羟基化反应
环糊精的应用实例1
• Chincholkar 等研究了在环糊精存在时， Currularia VKMF-644对11－脱氢皮甾醇 （Reichstein S化合物，简称化合物S） 的11羟基化。 在底物浓度为4g/L时： • 化合物S： －CD＝1.0:0.6 氢化可的松 的产率为70％－75％ • 无－CD： 氢化可的松的产率 为40％－50％
同位素实验证明
甾体羟基化中存在的问题
环糊精的生理作用
Hesselink等研究： 应用环糊于分枝杆菌 甾体边链的降解。 环糊精是一种环状寡聚糖，一般由6－8个 葡萄糖分子通过－1，4糖苷键连接而成。 易溶于水。 含有疏水性空腔，可与疏水性分子结合。 可作为几种甾体类药物的稳定剂和增溶剂。
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