免疫学检测技术PPT课件
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31
5 )免疫胶体金技术
用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗 体的方法
32
6 )免疫印迹法（Western blotting）
该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测 技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体， 再用酶免疫、放射免疫技术测定。
常用于检测多种蛋白质
33
免 疫 印 迹 法 示 意 图
46
2. 免 疫 磁 珠 细 胞 分 离
18
常用酶及其底物
辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）
19
分类
20
双抗体夹心法
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等
21
特点：
非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇
的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
1．直接凝集试验 玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，
细菌的鉴定、分型等。 试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。
2．间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。
9
10
（二）沉淀反应 可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与
相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。 因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
免疫酶技术
免疫荧光技术
放射免疫测定法
发光免疫分析
免疫胶体金技术
17
1)免疫酶测定法 （Enzyme Immunoassay,
EIA）
利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原 或抗体的方法
特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性， 以及酶催化底物反应的生物放大作用, 最后用酶标仪测定光密度值（OD），评 定抗原-抗体的含量。
免疫学检测技术
.
1
第一节 体外抗原抗体结合反 应的特点及影响因素
2
一. 体外抗原抗体反应的特征
高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合 点结构互补。
表面化学基团之间的可逆性结合 适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体反应的两个阶段
3
高度专一性的结合
4
可逆性结合
Equivalence – Lattice formation
5
抗原抗体比例对反应现象 的影响
6
抗原抗体反应的影响因素
电解质：可促进抗原与抗体的结合。 常用生理盐水。
温度：最适温度为37℃。 酸碱度：最适pH =6-8。
7
第二节 检测抗原或抗体的 体外试验
8
（一）凝集反应 颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体
结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。
15
（三）免疫标记技术
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
16
常用的标记物
wk.baidu.com
酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质 及胶体金
优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以 对微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术主要类型：
又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。
11
琼脂凝胶
12
1．单向免疫扩散 用于定量测抗原。
如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。
13
2．双向免疫扩散
主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种抗原相关性分析
14
3．免疫电泳
其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可 用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
22
间接法ELISA
乙肝标志物中 抗HBs的检测 常采用本法
23
2 )免疫荧光技术
(Immunofluorescence Technique) 用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原 或抗体的方法
24
常用荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC）， 显黄绿色。 藻红蛋白（PE），显红色。
用途：细胞表面CD分子 抗核抗体
25
26
27
28
3 )放射免疫测定法（RIA）
用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体 的方法
敏感度可达pg水平， 其标记物为125I、131I等。 常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。
29
4 )发光免疫分析
immunoassay LIA)
(luminescence
43
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
44
密度梯度离心(Ficoll)离心
45
（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析
免疫吸附分离法 免疫磁珠法 荧光激活细胞分离仪分离法
（ (Fluorescence Activated Cell Sorting)， FACS ） 抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL
单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
34
35
4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列
是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱 分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白 质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点 等。
36
原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质
载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质 的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与 其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质 及其表达数量。
5 )免疫胶体金技术
用胶体金标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗 体的方法
32
6 )免疫印迹法（Western blotting）
该法是将凝胶电泳与固相免疫相接合的检测 技术，即将电泳分区的蛋白质转移到固相载体， 再用酶免疫、放射免疫技术测定。
常用于检测多种蛋白质
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免 疫 印 迹 法 示 意 图
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2. 免 疫 磁 珠 细 胞 分 离
18
常用酶及其底物
辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP）
19
分类
20
双抗体夹心法
在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原， 例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等
21
特点：
非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇
的多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
1．直接凝集试验 玻片凝集试验：用于定性测抗原。如ABO血型鉴定，
细菌的鉴定、分型等。 试管凝集试验：用于定量测抗体，如肥达氏反应。
2．间接凝集试验 如类风湿因子的测定等。
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（二）沉淀反应 可溶性抗原（血清蛋白、组织浸液等）与
相应抗体结合而形成可见沉淀物的反应。 因该类反应多在半固体琼脂凝胶中进行，故
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第三节 免疫细胞功能的检测
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39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
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(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
免疫酶技术
免疫荧光技术
放射免疫测定法
发光免疫分析
免疫胶体金技术
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1)免疫酶测定法 （Enzyme Immunoassay,
EIA）
利用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原 或抗体的方法
特点：利用抗原-抗体反应的高度特异性， 以及酶催化底物反应的生物放大作用, 最后用酶标仪测定光密度值（OD），评 定抗原-抗体的含量。
免疫学检测技术
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1
第一节 体外抗原抗体结合反 应的特点及影响因素
2
一. 体外抗原抗体反应的特征
高度特异性：抗原的表位与抗体的抗原结合 点结构互补。
表面化学基团之间的可逆性结合 适宜的抗原抗体浓度和比例 抗原抗体反应的两个阶段
3
高度专一性的结合
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可逆性结合
Equivalence – Lattice formation
5
抗原抗体比例对反应现象 的影响
6
抗原抗体反应的影响因素
电解质：可促进抗原与抗体的结合。 常用生理盐水。
温度：最适温度为37℃。 酸碱度：最适pH =6-8。
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第二节 检测抗原或抗体的 体外试验
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（一）凝集反应 颗粒性抗原（RBC、细菌等）与相应抗体
结合形成肉眼可见凝集物的现象或反应。
15
（三）免疫标记技术
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
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常用的标记物
wk.baidu.com
酶、荧光素、放射性核素、化学发光物质 及胶体金
优点：极大的提高了反应的灵敏度，可以 对微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术主要类型：
又称为琼脂扩散试验或免疫扩散。
11
琼脂凝胶
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1．单向免疫扩散 用于定量测抗原。
如检测血清免疫球蛋白、C3等含量。
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2．双向免疫扩散
主要用于定性检测抗原或抗体，抗原组成及两 种抗原相关性分析
14
3．免疫电泳
其方法是先电泳、后扩散。主要用于抗原成分的分析，亦可 用于诊断如骨髓瘤、性联低丙种球蛋白血症等的诊断
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
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间接法ELISA
乙肝标志物中 抗HBs的检测 常采用本法
23
2 )免疫荧光技术
(Immunofluorescence Technique) 用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原 或抗体的方法
24
常用荧光素 异硫氰酸荧光素（FITC）， 显黄绿色。 藻红蛋白（PE），显红色。
用途：细胞表面CD分子 抗核抗体
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3 )放射免疫测定法（RIA）
用放射性核素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体 的方法
敏感度可达pg水平， 其标记物为125I、131I等。 常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。
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4 )发光免疫分析
immunoassay LIA)
(luminescence
43
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
44
密度梯度离心(Ficoll)离心
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（二）淋巴细胞及其亚群的分离和分析
免疫吸附分离法 免疫磁珠法 荧光激活细胞分离仪分离法
（ (Fluorescence Activated Cell Sorting)， FACS ） 抗原肽-MHC分子四聚体技术分析CTL
单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
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细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
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不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
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4.蛋白质芯片技术：又称蛋白质微阵列
是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱 分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白 质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点 等。
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原理：是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介质
载体上成为检测的芯片，然后，用标记了有特定荧光物质 的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与 其对应的蛋白质结合，抗体上的荧光将指示对应的蛋白质 及其表达数量。