现代分子诊断技术培训资料
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2020/8/20
• 分离杂交探针的方法：
1. 提取某一病原微生物株系的染色体DNA ； 2. 限制性内切酶进行酶解 ； 3. 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文
库； 4. 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原
性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、 筛选。
2020/8/20
• 核酸杂交的灵敏度和可靠性极高； • 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组
• 单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置
2020/8/20
酶联免疫吸附测定的局限性
• 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能 作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须 进行western检测。
• 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特 异性。
• 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位 点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方 式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结 合。
2020/8/20
检测过程： ①将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上； ②加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary
antibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去； ③加入二抗（secondary antibody）。二抗通常只特异的识别
一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷 酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反 应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后， 再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去。 ④加入无色底物。
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)
2020/8/20
酶联免疫吸附测定的原理
工作原理：
• 主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合。 • 假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于
检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体。
织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化 DNA； • 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的 序列扩增，再进行杂交检测。
从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用 于对所有的致病微生物的检测。
2020/8/20
非同位素标记探针
• 32P的缺点： 1. 半衰期短，仅13天； 2. 操作起来比较危险； 3. 必须要有特殊的实验室设备进行操作； 4. 放射性垃圾的处理繁琐。
2020/8/20
步骤：
• ①将单链目的DNA结合于膜上； • ②加入单链、标记过的探针DNA，在一定温度和
离子浓度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对 ； • ③冲洗，洗去多余的未结合的标记探针DNA； • ④检测探针和目标DNA形成的杂合分子。
2020/8/20
杂交探针
• 必须是高度特异性的DNA片段 • 种级探针：区分两个或多个物种 • 亚种级探针：区分物种内特定的株系 • DNA • RNA • 化学合成或克隆的完整基因 • 基因的一个片段
2020/8/20
• 传统的诊断程序
– 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的 生理学特性；
– 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌 ，还是其他物质。
– 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比 较特异；
– 诊断成本高、速度慢、效率低。 – 如砂眼衣原体、朊病毒
2020/8/20
• 现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分 子生物学的方法对病原物质进行诊断检测。
2020/8/20
第二节 DNA诊断系统
• DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学 特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作 为专一性的诊断标记。
2020/8/20
一、核酸杂交
• 工作原理： ◆ 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成 氢键。
• 3个关键要素： ★ 探针DNA ★目的DNA ★ 信号检测
2020/8/20
2020/8/20
ELISA程序和结果
• 使用多克隆抗体的缺点
①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备 的抗体的量之间也会有差异。
②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之 间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分， 因为在ELISA检测中都会发生颜色变化。
2020/8/20
• 非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学
发光物质而达到放大信号的目的。 • 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的
方法制备探针。 • 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年。 • 检测发光和颜色变化可在几小时内完成。
2020/8/20
与目的DNA杂交
2020/8/20
发出荧光
目的DNA
疟疾的分子诊断：
• 检测是否存在疟原虫
1. 抽取血样进行镜检 2. 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体
无法区分是以前感染还是现在感染
3. DNA杂交诊断
2020/8/20
• DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA 序列。
• 具体的分离过程： 1. 构建一个疟原虫的核基因文库; 2. 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库; 3. 选出那些杂交信号最强的克隆; 4. 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属
• 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分
子产生阳性反应； 2、灵敏度(sensitivity)高； 3、操作简单(simplicity).
2020/8/20
第一节酶联免疫吸附测定
• 抗体高度特异地与抗原分子结合 • 通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测
中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片 段作为DNA探针的可靠性。
2020/8/20
锥虫的检测
• 锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经 系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞。
Fra Baidu bibliotek物素 B
探针
目的DNA
B
加入链霉素抗生物蛋白
加入生物素标记的碱性磷酸酶
B
B AP
加入不同的生色或化学发光底物
B
B AP
2020/8/20
荧光标记的引物直接进行PCR检测
引物1
DNA
PCR
引物2
荧光染料
层析
荧光检测
2020/8/20
游离引物
• 分子夹心探针检测
分子夹心探针 (没有荧光)
荧光团
猝灭剂
• 分离杂交探针的方法：
1. 提取某一病原微生物株系的染色体DNA ； 2. 限制性内切酶进行酶解 ； 3. 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文
库； 4. 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原
性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、 筛选。
2020/8/20
• 核酸杂交的灵敏度和可靠性极高； • 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组
• 单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置
2020/8/20
酶联免疫吸附测定的局限性
• 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能 作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须 进行western检测。
• 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特 异性。
• 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位 点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方 式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结 合。
2020/8/20
检测过程： ①将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上； ②加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary
antibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去； ③加入二抗（secondary antibody）。二抗通常只特异的识别
一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷 酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反 应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后， 再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去。 ④加入无色底物。
酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)
2020/8/20
酶联免疫吸附测定的原理
工作原理：
• 主要是利用了一抗与目标分子的特异性结合。 • 假定目标分子是一种蛋白质，那么要得到可用于
检测的抗体，则首先需要纯化出这种蛋白质，然 后用纯化的蛋白质免疫动物（一般是兔子），在 免疫过程中兔子的血清就会产生多克隆抗体。
织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化 DNA； • 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的 序列扩增，再进行杂交检测。
从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用 于对所有的致病微生物的检测。
2020/8/20
非同位素标记探针
• 32P的缺点： 1. 半衰期短，仅13天； 2. 操作起来比较危险； 3. 必须要有特殊的实验室设备进行操作； 4. 放射性垃圾的处理繁琐。
2020/8/20
步骤：
• ①将单链目的DNA结合于膜上； • ②加入单链、标记过的探针DNA，在一定温度和
离子浓度下使探针分子与目标DNA分子碱基配对 ； • ③冲洗，洗去多余的未结合的标记探针DNA； • ④检测探针和目标DNA形成的杂合分子。
2020/8/20
杂交探针
• 必须是高度特异性的DNA片段 • 种级探针：区分两个或多个物种 • 亚种级探针：区分物种内特定的株系 • DNA • RNA • 化学合成或克隆的完整基因 • 基因的一个片段
2020/8/20
• 传统的诊断程序
– 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的 生理学特性；
– 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌 ，还是其他物质。
– 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比 较特异；
– 诊断成本高、速度慢、效率低。 – 如砂眼衣原体、朊病毒
2020/8/20
• 现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分 子生物学的方法对病原物质进行诊断检测。
2020/8/20
第二节 DNA诊断系统
• DNA诊断的理论基础：任何一个决定生物学 特性的DNA序列都应该是独特的，都可以作 为专一性的诊断标记。
2020/8/20
一、核酸杂交
• 工作原理： ◆ 两条DNA链之间可以通过碱基配对而形成 氢键。
• 3个关键要素： ★ 探针DNA ★目的DNA ★ 信号检测
2020/8/20
2020/8/20
ELISA程序和结果
• 使用多克隆抗体的缺点
①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备 的抗体的量之间也会有差异。
②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之 间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分， 因为在ELISA检测中都会发生颜色变化。
2020/8/20
• 非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学
发光物质而达到放大信号的目的。 • 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的
方法制备探针。 • 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年。 • 检测发光和颜色变化可在几小时内完成。
2020/8/20
与目的DNA杂交
2020/8/20
发出荧光
目的DNA
疟疾的分子诊断：
• 检测是否存在疟原虫
1. 抽取血样进行镜检 2. 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体
无法区分是以前感染还是现在感染
3. DNA杂交诊断
2020/8/20
• DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA 序列。
• 具体的分离过程： 1. 构建一个疟原虫的核基因文库; 2. 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库; 3. 选出那些杂交信号最强的克隆; 4. 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属
• 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分
子产生阳性反应； 2、灵敏度(sensitivity)高； 3、操作简单(simplicity).
2020/8/20
第一节酶联免疫吸附测定
• 抗体高度特异地与抗原分子结合 • 通过抗原-抗体的特异识别反应进行检测
中不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片 段作为DNA探针的可靠性。
2020/8/20
锥虫的检测
• 锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经 系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞。
Fra Baidu bibliotek物素 B
探针
目的DNA
B
加入链霉素抗生物蛋白
加入生物素标记的碱性磷酸酶
B
B AP
加入不同的生色或化学发光底物
B
B AP
2020/8/20
荧光标记的引物直接进行PCR检测
引物1
DNA
PCR
引物2
荧光染料
层析
荧光检测
2020/8/20
游离引物
• 分子夹心探针检测
分子夹心探针 (没有荧光)
荧光团
猝灭剂