实验八 亲和纯化GST融合蛋白

实验八单柱亲和纯化GST融合蛋白
Single Column Purification of GST Fusion Proteins
N末端或C末端GST融合蛋白
纯化方法
运用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(0.5-2 ml) 谷胱甘肽树脂预装柱(0.5-1 ml) 进行GST融合蛋白纯化的方法，适用于25-100 ml的诱导培养菌(纯化2.5-10 mg GST融合蛋白)
1. 细菌培养：直接挑取表达质粒新转化的单菌落, 加入25-100 ml LB+Amp液体培养基中（含
氨苄100 μg/ml），37℃振荡培养至OD600nm达0.5。

2. 诱导蛋白表达：加入终浓度为0.3 mM 的IPTG，30-37℃振荡培养3 h，诱导蛋白表达。

设立
阴性对照。

取样10-20 μl进行SDS-PAGE电泳, 取样1-2 μl进行Western blot鉴定。

表达的时间和温度根据表达量, 可溶性和稳定性进行调整, 对于37℃不稳定或不溶的蛋白, 0.1 mM 的IPTG 20-25℃诱导培养6-20 h; 10-16℃振荡培养12-24 h.
3．细胞收集：5000×g离心10分钟(4℃), 弃上清。

-20/-80℃贮存。

细胞冻融利于破碎。

4．破碎细胞:用5-10 ml的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1 NaCl) 将菌体重悬，超声破碎细胞(冰浴)，使融合蛋白释放。

15000-19000×g离心30分钟，上清即为可溶性蛋白的细胞粗提物。

上样5 μl进行SDS-PAGE电泳鉴定（Western:: 1∶10稀释, 上样5 μl）。

5．谷胱甘肽树脂预装柱的平衡: 20 ml的缓冲液4℃进行柱平衡。

每毫升谷胱甘肽树脂大约能够结合5-10 mg GST融合蛋白。

6．结合融合蛋白：用柱帽堵上，将澄清的细胞粗提物加入谷胱甘肽树脂预装柱(0.5 ml, # ;
1 ml, # )，4℃放置15-30 min。

取少量流过液(上样5 μl)，并与细胞粗提物的PAGE电泳进行比较，鉴定蛋白结合效率。

7．洗柱：用10X 5-8 mL的缓冲液洗柱，可用
2x5 ml高盐缓冲液(0.5 M NaCl)洗柱。

8．融合蛋白的洗脱：用1-2 ml (每管~1/2柱床
体积) 10 mM 谷胱甘肽(# )的缓冲液将
目的蛋白洗脱, 收集4-6管。

9．SDS-PAGE电泳分析:上样5-15 μl进行
SDS-PAGE电泳鉴定。

可通过280 nm UV 吸光
值或Bradford蛋白检测法进行检测。

10. 树脂的再生：树脂可通过以下步骤再生重复使用3-5次。

用3倍柱床体积的0.3 M NaOH （即蛋白剥脱液Stripping Solution）漂洗，使树脂在该液中浸泡10分钟后，用10倍柱床体积的水和2倍柱床体积的Column Buffer漂洗。

树脂可贮存于4℃。