GST融合蛋白的纯化

GST融合蛋白的纯化

诱导和收集菌体

在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。IPTG浓度一般为

0.1～1.0mM。

5000rpm 5min离心收集菌体。

亲和层析柱的制备

取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。

将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。

每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。

在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。

将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。

收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。

0.45um过滤后加入亲和层析柱。

室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。

用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。

配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。

用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。

测各管洗脱液蛋白浓度。

PAGE电泳检测纯度。

亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。或者按照beads使用说明书上的方法再生。

如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。

如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。