GST_catenin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
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【摘 要 】 目 的 构 建 GST-β-catenin 融 合 蛋 白 表 达 载 体 ，并 在 大 肠 埃 希 菌 （E．col）中 诱 导 表 达 。 方 法 从 COS-7 细 胞 中 提 取 mRNA，反 转 录 为 cDNA。 用 PCR 方 法 扩 增 出 β-catenin 基 因 全 长 ，通 过 BamHI 和 SalI 酶 切 位 点 将 其 定 向 插 入 pGEX-4T2 载 体 中 ， 构 建 原 核 表 达 质 粒 pGEX-4T-2-β-catenin， 并 转 化 E．coli DH5α， 通 过 限 制 性 内 切 酶 酶 切 电 泳 和 DNA 测 序 鉴 定 正 确 后 ，转 入 E．coli BL21 中 ， 经 异 丙 基 硫 代 β-D 半 乳 糖 苷 大 量 诱 导 表 达 ，SDS-PAGE 电 泳 和 Western blot 鉴 定 。 结 果 酶 切 电 泳 及 测 序 结 果 证 明 ， 成 功 构 建 了 原 核 表 达 质 粒 GST-β-catenin， 并 用 Western blot 方 法 证 实 了 GST-β-catenin 融 合 蛋 白 的 表 达 。 结 论 成 功 构 建 了 GST-β-catenin 原 核 表 达 载 体 ， 并 证 实 了 其 在 原 核 细 胞 大 肠 埃 希 菌 中 的 表 达 ， 为 进 一 步 纯 化 β-catenin 及 研 究 其 结 构 与 功 能 提 供 了 前 提 基 础 。
1 材料与方法
1．1 RNA 提取及反转录 COS-7 细胞培养并提取总 RNA。 混匀后裂解。 按
说明书提取 RNA。测 RNA 的 A 值，计算比值和浓度。 操作步骤按照 TaKaRa 反转录试剂盒说明书进行。 1．2 β-catenin 全长基因扩增
以 COS-7 细胞 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，上 游 引 物 ：5′ -CTGCGGATCCATGGCTACTCAAGCTG3′， 下游引物：5′-CACTGTCGACTTACAGGTCAGTA TCAAAC-3′。 PCR 反应体系为 50 μL，PCR 反应条件 为：95 ℃ 5 min 预变性；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。 扩增产物琼脂糖凝胶 电泳后，凝胶回收约 2 346 bp 的 PCR 产物。 1．3 pGEX-4T-2-β-catenin 表达载体的构建
解 剖 学 研 究 2015 年 第 37 卷 第 2 期 Anat Res, 2015, Vol． 37, No．2
由 于 β-catenin 在 经 典 的 WNT 信 号 通 路 中 的关键调控蛋白， 对其功能及作用机制的研究 已 逐 渐 引 起 人 们 的 重 视 。 为 深 入 研 究 β-catenin 的生物学作用和分子机制，本研究中利用分子克 隆 技 术 成 功 构 建 了 β-catenin 基 因 原 核 表 达 载 体， 并在大肠埃希菌中诱导表达其融合蛋白，为 β-catenin 的 结 构 功 能 及 其 信 号 通 路 的 研 究 提 供 了基础。
诱 导 后 的 细 菌 沉 淀 菌 体 ，冰 上 超 声 破 碎 30 s； 离心 15 min； 加入 50 ％的 GST Sepharose beads 30 μl，4 ℃ 孵 育 3 h 后 500 g 离 心 1 min； 用 NP-40 buffer 洗 beads；SDS-PAGE 电泳后考马斯亮蓝染 色 检测纯化结果。
【Abstract】 Objective To construct GST-β-catenin fusion protein expression vector and induce its expression in Escherichia coli （E．coli）． Methods Total mRNA was extracted from COS-7 cells ， and cDNA was formed by reverse transcription． Theβ-catenin coding sequence was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and subcloned into pGEX-4T-2 vector． The positive recombinant was identified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing． Then they were transformed into E．coli BL21， induced by IPTG and identified by SDS-PAGE and Western blot． Results The prokaryotic expression plasmid pGEX-4T2-β-catenin was successfully constructed and confirmed by enzyme digestion and sequencing． The GST- β-catenin fusion proteins were expressed and confirmed by Western blot． Conclusion The prokaryotic expression plasmid ofβ-catenin was successfully constructed and the expression of fusion proteins in E．coli was confirmed． This study provides the basis for the further research on purifying Vinexin protein and the biological function ofβ-catenin．
105
1．6 Western blot 分析 将 上 述 诱 导 表 达 后 的 蛋 白 经 10％ SDS-PAGE
凝 胶 分 离 ， 恒 流 转 移 至 PVDF 膜 上 ，4 ℃ 过 夜 ， 用 5％脱 脂 奶 粉 封 闭 3 h，TBST 洗 膜 ， 加 入 抗 GST 抗 体（1∶1 000），4 ℃过夜，TBST 洗膜。 加入辣根 过 氧 化物酶标记的羊抗鼠（1∶5 000）二抗室温 孵 育 2 h， TBST 洗膜。 ECL 显色，发光。
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （31201053） 通 信 作 者 ：梁 峰 ， Email： 215393787＠qq．com
跨膜受体 Fzd 以及 Lrp5 ／ Lrp6 结 合 形 成 复 合 物 ，然 后 Lrp5 ／ Lrp6 被 CKI 和 GSK3 激 酶 磷 酸 化 ［7］， 同 时 结合 Wnt 的 Fzd 也募集 磷 酸 化 的 DVL。 此 时 形 成 的 AXIN- Lrp5 ／ Lrp6-DVL 导 致 降 解 复 合 体 的 失 活 ，因 此 β-catenin 也 就 不 会 被 磷 酸 化 和 降 解 。 当 胞 内 β-catenin 达 到 一 定 的 水 平 时 ，形 成 的 游 离 的 β-catenin 进入胞核内［8］，并与转录因子 Lef1 ／ Tcf 结 合形成，最终导致靶基因的活化。 经典通路调控细 胞生长增殖的关键途径，在胚胎发育和肿瘤发生中 起着重要作用。 近年的研究表明经 典 的 Wnt 通 路 的异常活化是结肠癌和肝癌等多种癌症的一个标 志 ［9］。
将 pGEX-4T-2 载 体 和 β-catenin PCR 产 物 分 别 用 Bam HⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 ，T4 DNA 连 接 酶 4 ℃连接过夜，然后转化到 DH5α 感受态细胞中。 提 取质粒后酶切及测序验证。 1．4 重组蛋白在原核细胞中的大量诱导表达
将 鉴 定 正 确 的 重 组 质 粒 pGEX-4T-2-β-catenin 及 pGEX-4T-2 空 载 体 转 化 大 肠 杆 菌 BL214。 提 取 质 粒 DNA，经 BamHI 和 SalI 双 酶 切 后 鉴 定 阳 性 克 隆。
2结果
2．1 PCR 反应扩增 β-catenin 基因全长 以 COS-7 细 胞 cDNA 为 模 板 ， 应 用 设 计 的 引
物 进 行 β-catenin 基 因 PCR 扩 增 ，可 见 约 2 346 bp 的特异性片段（图 1），与预期相符。
图 1 β-catenin cDNA 的 PCR 反 应 扩 增 M． marker DNA EcoRⅠ ／ HindⅢ digested； Lane 1， PCR product of β -catenin
【Key words】 β-catenin； Prokaryotic expression； Fusion protein
Wnt信 号 通 路 是 目 前 已 知 的 胚 胎 发 育 和 肿 瘤 发 生 中 的 重 要 信 号 通 路 ［1－2］。 研 究 发 现 其 转 导 途 径 主 要 有 3 条 ：存 在 最 为 广 泛 的 经 典 主 线 是 Wntβ-catenin-Lef1 ／ Tcf；Wnt-Ca2 ＋ 途 径 和 Wnt-planar 极 化 途 径 ［3－5 ］ 。 当 不 存 在 Wnt 信 号 时 ， β - catenin 与 GSK3、Axin、APC 和 CKI 组成复合物， 其中 CKI 和 GSK3 先后将 β-catenin 磷 酸 化 ［6］，然 后 被 泛 素 蛋 白 酶体所识别和降解， 维持胞内 β-catenin 的在低水 平。 而当经典途径被激活后，分泌到胞外的 Wnt 与
2．2 GST-β-catenin 原核表达载体的构建及鉴定 重 组 质 粒 GST-β-catenin 经 EcoR Ⅰ 和 Xho Ⅰ
双 酶 切 后 得 到 约 4．9 ku（载 体 ） 和 2 346（片 段 ）的 两条带（图 2），进一步测序鉴定正确。 2．3 GST-β-catenin 重 组 质 粒 在 大 肠 埃 希 菌 中 的 诱导表达
BL21 菌 种 以 1 ∶1 000 的 比 例 加 入 到 含 有 50 μg ／ ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中。 次日，将 1 mL 菌液加入到 100 mL 的 LB 培养基中，37 源自文库 225 rpm 振 荡 培 养 至 对 数 中 期 （A550＝0．5～1．0）， 加 入 IPTG （终浓度为 1 mmol ／ L），30 ℃ 继续培养 3 h。 1．5 GST-融合蛋白的纯化
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解 剖 学 研 究 2015 年 第 37 卷 第 2 期 Anat Res, 2015, Vol． 37, No．2
· 论著 ·
GST-β-catenin 融合蛋白表达载体的构建及其在 原核细胞中的表达
梁 峰， 沈 涛， 姚 强， 贾长青 （中国医科大学附属盛京医院骨一科， 辽宁 沈阳 110004）
【关 键 词 】 β-catenin； 原 核 表 达 ； 融 合 蛋 白
Construction of GST-β-catenin fusion protein expression vectors and the expression in prokaryotic cell LIANG Feng， SHEN Tao， YAO Qiang， JIA Chang-qing． Department of Orthopedic Surgery， Shengjing Hospital of China Medical University， Shenyang 110004， China Corresponding author： LIANG Feng， Email： 215393787＠qq．com
1 材料与方法
1．1 RNA 提取及反转录 COS-7 细胞培养并提取总 RNA。 混匀后裂解。 按
说明书提取 RNA。测 RNA 的 A 值，计算比值和浓度。 操作步骤按照 TaKaRa 反转录试剂盒说明书进行。 1．2 β-catenin 全长基因扩增
以 COS-7 细胞 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，上 游 引 物 ：5′ -CTGCGGATCCATGGCTACTCAAGCTG3′， 下游引物：5′-CACTGTCGACTTACAGGTCAGTA TCAAAC-3′。 PCR 反应体系为 50 μL，PCR 反应条件 为：95 ℃ 5 min 预变性；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 3 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。 扩增产物琼脂糖凝胶 电泳后，凝胶回收约 2 346 bp 的 PCR 产物。 1．3 pGEX-4T-2-β-catenin 表达载体的构建
解 剖 学 研 究 2015 年 第 37 卷 第 2 期 Anat Res, 2015, Vol． 37, No．2
由 于 β-catenin 在 经 典 的 WNT 信 号 通 路 中 的关键调控蛋白， 对其功能及作用机制的研究 已 逐 渐 引 起 人 们 的 重 视 。 为 深 入 研 究 β-catenin 的生物学作用和分子机制，本研究中利用分子克 隆 技 术 成 功 构 建 了 β-catenin 基 因 原 核 表 达 载 体， 并在大肠埃希菌中诱导表达其融合蛋白，为 β-catenin 的 结 构 功 能 及 其 信 号 通 路 的 研 究 提 供 了基础。
诱 导 后 的 细 菌 沉 淀 菌 体 ，冰 上 超 声 破 碎 30 s； 离心 15 min； 加入 50 ％的 GST Sepharose beads 30 μl，4 ℃ 孵 育 3 h 后 500 g 离 心 1 min； 用 NP-40 buffer 洗 beads；SDS-PAGE 电泳后考马斯亮蓝染 色 检测纯化结果。
【Abstract】 Objective To construct GST-β-catenin fusion protein expression vector and induce its expression in Escherichia coli （E．coli）． Methods Total mRNA was extracted from COS-7 cells ， and cDNA was formed by reverse transcription． Theβ-catenin coding sequence was amplified by polymerase chain reaction （PCR） and subcloned into pGEX-4T-2 vector． The positive recombinant was identified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing． Then they were transformed into E．coli BL21， induced by IPTG and identified by SDS-PAGE and Western blot． Results The prokaryotic expression plasmid pGEX-4T2-β-catenin was successfully constructed and confirmed by enzyme digestion and sequencing． The GST- β-catenin fusion proteins were expressed and confirmed by Western blot． Conclusion The prokaryotic expression plasmid ofβ-catenin was successfully constructed and the expression of fusion proteins in E．coli was confirmed． This study provides the basis for the further research on purifying Vinexin protein and the biological function ofβ-catenin．
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1．6 Western blot 分析 将 上 述 诱 导 表 达 后 的 蛋 白 经 10％ SDS-PAGE
凝 胶 分 离 ， 恒 流 转 移 至 PVDF 膜 上 ，4 ℃ 过 夜 ， 用 5％脱 脂 奶 粉 封 闭 3 h，TBST 洗 膜 ， 加 入 抗 GST 抗 体（1∶1 000），4 ℃过夜，TBST 洗膜。 加入辣根 过 氧 化物酶标记的羊抗鼠（1∶5 000）二抗室温 孵 育 2 h， TBST 洗膜。 ECL 显色，发光。
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （31201053） 通 信 作 者 ：梁 峰 ， Email： 215393787＠qq．com
跨膜受体 Fzd 以及 Lrp5 ／ Lrp6 结 合 形 成 复 合 物 ，然 后 Lrp5 ／ Lrp6 被 CKI 和 GSK3 激 酶 磷 酸 化 ［7］， 同 时 结合 Wnt 的 Fzd 也募集 磷 酸 化 的 DVL。 此 时 形 成 的 AXIN- Lrp5 ／ Lrp6-DVL 导 致 降 解 复 合 体 的 失 活 ，因 此 β-catenin 也 就 不 会 被 磷 酸 化 和 降 解 。 当 胞 内 β-catenin 达 到 一 定 的 水 平 时 ，形 成 的 游 离 的 β-catenin 进入胞核内［8］，并与转录因子 Lef1 ／ Tcf 结 合形成，最终导致靶基因的活化。 经典通路调控细 胞生长增殖的关键途径，在胚胎发育和肿瘤发生中 起着重要作用。 近年的研究表明经 典 的 Wnt 通 路 的异常活化是结肠癌和肝癌等多种癌症的一个标 志 ［9］。
将 pGEX-4T-2 载 体 和 β-catenin PCR 产 物 分 别 用 Bam HⅠ 和 SalⅠ 双 酶 切 ，T4 DNA 连 接 酶 4 ℃连接过夜，然后转化到 DH5α 感受态细胞中。 提 取质粒后酶切及测序验证。 1．4 重组蛋白在原核细胞中的大量诱导表达
将 鉴 定 正 确 的 重 组 质 粒 pGEX-4T-2-β-catenin 及 pGEX-4T-2 空 载 体 转 化 大 肠 杆 菌 BL214。 提 取 质 粒 DNA，经 BamHI 和 SalI 双 酶 切 后 鉴 定 阳 性 克 隆。
2结果
2．1 PCR 反应扩增 β-catenin 基因全长 以 COS-7 细 胞 cDNA 为 模 板 ， 应 用 设 计 的 引
物 进 行 β-catenin 基 因 PCR 扩 增 ，可 见 约 2 346 bp 的特异性片段（图 1），与预期相符。
图 1 β-catenin cDNA 的 PCR 反 应 扩 增 M． marker DNA EcoRⅠ ／ HindⅢ digested； Lane 1， PCR product of β -catenin
【Key words】 β-catenin； Prokaryotic expression； Fusion protein
Wnt信 号 通 路 是 目 前 已 知 的 胚 胎 发 育 和 肿 瘤 发 生 中 的 重 要 信 号 通 路 ［1－2］。 研 究 发 现 其 转 导 途 径 主 要 有 3 条 ：存 在 最 为 广 泛 的 经 典 主 线 是 Wntβ-catenin-Lef1 ／ Tcf；Wnt-Ca2 ＋ 途 径 和 Wnt-planar 极 化 途 径 ［3－5 ］ 。 当 不 存 在 Wnt 信 号 时 ， β - catenin 与 GSK3、Axin、APC 和 CKI 组成复合物， 其中 CKI 和 GSK3 先后将 β-catenin 磷 酸 化 ［6］，然 后 被 泛 素 蛋 白 酶体所识别和降解， 维持胞内 β-catenin 的在低水 平。 而当经典途径被激活后，分泌到胞外的 Wnt 与
2．2 GST-β-catenin 原核表达载体的构建及鉴定 重 组 质 粒 GST-β-catenin 经 EcoR Ⅰ 和 Xho Ⅰ
双 酶 切 后 得 到 约 4．9 ku（载 体 ） 和 2 346（片 段 ）的 两条带（图 2），进一步测序鉴定正确。 2．3 GST-β-catenin 重 组 质 粒 在 大 肠 埃 希 菌 中 的 诱导表达
BL21 菌 种 以 1 ∶1 000 的 比 例 加 入 到 含 有 50 μg ／ ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中。 次日，将 1 mL 菌液加入到 100 mL 的 LB 培养基中，37 源自文库 225 rpm 振 荡 培 养 至 对 数 中 期 （A550＝0．5～1．0）， 加 入 IPTG （终浓度为 1 mmol ／ L），30 ℃ 继续培养 3 h。 1．5 GST-融合蛋白的纯化
104
解 剖 学 研 究 2015 年 第 37 卷 第 2 期 Anat Res, 2015, Vol． 37, No．2
· 论著 ·
GST-β-catenin 融合蛋白表达载体的构建及其在 原核细胞中的表达
梁 峰， 沈 涛， 姚 强， 贾长青 （中国医科大学附属盛京医院骨一科， 辽宁 沈阳 110004）
【关 键 词 】 β-catenin； 原 核 表 达 ； 融 合 蛋 白
Construction of GST-β-catenin fusion protein expression vectors and the expression in prokaryotic cell LIANG Feng， SHEN Tao， YAO Qiang， JIA Chang-qing． Department of Orthopedic Surgery， Shengjing Hospital of China Medical University， Shenyang 110004， China Corresponding author： LIANG Feng， Email： 215393787＠qq．com