GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11

作者简介:吴　爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。

GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化

吴　爽

1,2

,耿建国

2

(1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州　510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海　200031)

摘　要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶

切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。

关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51

文献标识码:A

文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03

P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发

挥重要作用[1]

。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌株、质粒　人源talin1的cDNA 及融合表达

载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5

α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2　生化试剂和分子生物学试剂　引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生

物公司产品。1.2　方法1.2.1　目的基因的扩增及纯化　根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI

酶切位点。PCR 反应总体积为50

μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2　pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建　将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815

μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3　重组质粒的筛选和鉴定　将连接产物全量转

化入DH5

α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。

3

3

1.2.4　融合蛋白的诱导表达　将测序正确的重组质

粒转化入BL21感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜后挑取单个菌落,经小抽酶切鉴定后保存菌液。将保存的pGEX 24T 212

talin1菌液经37℃过夜培养活化,以1∶200稀释接种于

10mL 的LB 培养基中(含Amp 100

μg/mL ),振荡培养3h 至OD 600≈016时,取出100

μL 的菌液作为阴性对照,然后加入终浓度为015mmol/L 的IPTG,诱导培养4h,取菌液收集菌体,超声破菌后离心,保存沉淀和上清,8%的S DS 2PAGE 电泳后考马思亮蓝染色鉴定。1.2.5　表达产物的亲和层析及纯化　11214所述的方法诱导表达效果较好,按此方法诱导1L 菌液,

5000r/m in,4℃离心15m in,将细菌沉淀重悬于20mL1

×PBS (pH 值714)中,并加入终浓度为2mM /L 的

P MSF,超声破碎后加入终浓度为10%的Triton 2100,冰上放置30m in,然后12000r/m in,4℃离心15m in,取上清准备亲和层析。

将2mL Glutathi one Sepharose 4B 加入柱子中,用250mL 左右的1×PBS (pH 值714)洗去保护液至柱子平衡,然后加入上述上清,使蛋白充分吸附。用1×PBS (pH 值714)洗涤层析柱至重新平衡,最后用洗脱液将目的蛋白洗脱。按照分子克隆(第三版)常规方法进行透析。紫外分光光度计测蛋白浓度

。

1、DNA 标准分子量;

2、PCR 扩增的人源talin1

图1　PCR 结果

Fig 1Amp lificati on result of PCR

1.2.6　W estern blot 检测　在两个EP 管中各加入

20

μL 的Glutathione Sephar ose 4B 球珠,T BS 彻底洗去保护液后,分别加入含有1

μg GST 蛋白和1μg GST 2tal 2in1融合蛋白的1mL 的T BS,4℃翻滚结合215h 。4℃

下1800r/m in 离心2m in,收集GST 2Sephar ose 4B 球珠,

用T BS 洗涤3次,彻底洗去未结合的杂蛋白,收集GST 2Sephar ose 4B 球珠,球珠中即为纯化的GST 2talin1融合蛋白和GST 蛋白。按常规方法进行western bl ot

检测。特异性抗GST 蛋白的单克隆抗体为试验室保存。2　结果2.1　目的基因的扩增及纯化

PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在大小约为214Kb 的位置有单一条带,与目的片断大小位置相符。2.2　重组质粒的鉴定结果

pGEX 24T 212talin1重组质粒经EcoR I/XhoI 双酶切后,有约214Kb 和419Kb 的两条酶切片断,分别与扩增的talin1目的片断和

pGEX 24T 21载体片段大小相符。

1、DNA 标准分子量;

2、酶切鉴定后的pGEX 24T 212talin1

图2　重组质粒鉴定结果

Fig 2Results of recombinant p la m id

2.3　测序结果

对pGEX 24T 212talin1重组质粒进行测序,结果显示与人源talin1cDNA 阅读框序列一致。

2.4　大肠杆菌的talin12GST 蛋白表达及纯化结果

S DS 2PAGE 电泳显示在细菌裂解液中有一条120kD 的较粗的蛋白条带,经I PTG 诱导表达后有所增

加,结果见图3。经亲和层析后,western 2blot

检测到在120kD 处有唯一条带,结果见图4。

1、蛋白分子量;

2、阴性对照;

3、菌体中表达的蛋白;

4、上清中表达的蛋白

图3　pGEX 24T 212talin1的S DS 2P AGE 的电泳结果

Fig 3Analysis of pGEX 24T 212talin1S DS 2P AGE

3　讨论

Talin 属于“band 411”蛋白超家族,是一种重要的

细胞骨架肌动蛋白结合蛋白[2]

。能够将成纤维细胞上的细胞表面受体蛋白(如:整合素蛋白)偶联到肌动蛋白细胞骨架上[3]

。由calpain 酶解而产生的talin 头部

区域可以结合并活化整合素蛋白(integrins )[2]

。在成

4

3