蛋白质工程制药--EPO1
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生物技术制药上游
蛋白质工程制药 ：EPO的改造
主讲人：Dr. 张杰
蛋白质工程简介 (PROTEIN ENGINEERING)
序论：蛋白质工程简介
蛋白质工程的含义 蛋白质工程的诞生 蛋白质工程的主要内容和基本目的 蛋白质工程与基因工程的区别 主要参考书
一 蛋白质工程的含义
蛋白质工程 根据蛋白质的精细结构
– The life cycle is very sophisticated – Initial infection transfers genetic material into
host with little membrane disruption. – Late infection stages perturb host membrane
for release of virions – M13 is non-lytic
M13 Structure
Dimensions:
– 6.5nm in diameter – Length dependant on genome but wild type
approximately 930nm – Mass 16.3MD of which 87% comprised of
3 来鲁华教授，女，博士，北京大学化学学院长江特聘 教授，北京大学理论生物学中心常务副主任，分子动态与稳态国 家重点实验室主任，国家重点基础研究发展规划项目首席科学家， 国家杰出青年基金获得者。1984年本科毕业于北京大学化学系， 1989年在北京大学化学系获博士学位。1998-1999年期间为美国加 州大学伯克莱分校伯克莱学者。承担过国家自然科学青年基金， 国家杰出青年基金，攀登计划项目，八六三项目等。获得过国家 自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖励，中国科协青年 科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。来鲁华教 授从1987年开始从事化学与生物学的交叉研究，特别是生物信息 学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作，近年 的主要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，发展了用于蛋白 质-蛋白质相互作用定量研究的平均势方法。
蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然 蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改 造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的， 具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过 漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋 白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望 能更快、更有效地为人类的需要服务。
和生物活力的作用机制之间 的关系，利用基因工程的手 段，按照人类自身的需要， 定向地改造天然的蛋白质或 设计制造新的蛋白质。
二 蛋白质工程的诞生
一张蓝图 上世纪70年代，特别是80年代初结构生物学揭
示了大量蛋白质分子的精确立体结构及其与复杂生 物学功能的关系，为设计改造天然蛋白质提供了蓝 图 一项工具
4该领域的其他著名学者：北大的顾孝诚, 北方基因中心于军、杨 焕明; 清华的李衍达、饶子和; 军科院贺福初、黄培堂、;协和的 沈岩; 瑞金医院的陈竺、 生化所的丁达夫、 上海生物信息中心 的赵国屏等
六 小结
蛋白质工程的主要内涵及基本目的； 蛋白质工程与基因工程的主要区别。
思考题：酶工程与蛋白质工程有什么区别？
两本书，一个人
1《蛋白质的结构预测与分子设计》 来鲁华著 北京大学出版 社,1993
2《PROTEIN STRUCTURE 》 Section 1.Primary structure, secondary motifs, tertiary architecture, and quaternary organization Jannette Carey and Vanessa Hanley Princeton University Princeton, NJ 08544-1009
三 蛋白质工程的主要内容和基本目的
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能关 系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合 成，对现有蛋白质加以定向改பைடு நூலகம்，设计，构 建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质 更加优良，更符合人类需要的新型蛋白质。
四 蛋白质工程与基因工程的区别
基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内， 并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在 的蛋白质（第一代）。
提示： 酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用， 借助工程学的手段，应用于生产、生活、 医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技 术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产 和应用两方面组成的。酶工程的应用主要 集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。
蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础， 通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造， 设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、 更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
Valery A. Petrenko
b. In 1949 ,has published over 70 papers and has 13 inventions and patents.
Overview
The past 10 years has seen remarkable progress in our understanding of the replication cycle of the M13 phage
protein
Genome:
– Single stranded circular DNA molecule, covalently closed
– Housed in a flexible protein cylinder
M13 Structure
Genome orientation
– 78 Nucleotide hairpin region called the packaging signal located at pVII/pIX terminus
published 35 papers in areas including antibody structure and
evolution, the evolution of repeated DNA sequences, genomics, and the biology of the filamentous phage. It is from his interest in the filamentous phage that the idea of phage display evolved.
M13 Structure
Proteins
– Length of phage cylinder comprises 2700 copies of the 50-amino-acid major coat protein pVIII
– At one terminus:
5 copies of 33 AA residue pVII 5 copies of 32 AA residue pIX
2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统
在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬 时表达系统，一是稳定表达系统。 瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段， 其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由 未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表 达的时间相对短，只有48h到7天。 稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月 的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中， 这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。
– At one terminus:
5 copies of 406 AA residue pIII 5 copies of 112 AA residue pVI
M13 Gene Functions
Gene II X V VIII III VI VII IX I IV XI
Function DNA Replication DNA Replication Binding ssDNA Major capsid protein Minor capsid protein Minor capsid protein Minor capsid protein Minor capsid protein Assembly Assembly Assembly
噬菌体显示(Phage display)对EPO分 子片段的筛选
关于噬菌体显示的表达载体 噬菌体显示技术的操作 EPO-EPOR EMP-EBP
George P. Smith
Valery A. Petrenko
George P. Smith
b. in 1941. Bsc. degree in biology in 1963, a Ph.D. in bacteriology and immunology from Harvard University in 1970. After a postdoctoral fellowship with Oliver Smithies at the University of Wisconsin, he joined the faculty of the Division of Biological Sciences at the University of Missouri in Columbia in 1975 as Assistant Professor and since has been promoted to Associate and Full Professor. He has
1983年，美国GENE公司的Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering‘’ (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工 程诞生的标志。(Kevin M. Ulmer ( Science 219:666-671). )
.
ABSTRCT
The prospects for protein engineering, including the roles of x-ray crystallography, chemical synthesis of DNA, and computer modelling of protein structure and folding, are discussed. It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis. Such techniques offer the potential for altering protein structure and function in ways not possible by any other method
思路不同：基因工程是遵循中心法则，从 DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上 是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是 按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋 白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状 态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可 以创造自然界不存在的蛋白质。
五 主要参考书
分子遗传学发展了以定点诱变为中心的基因操 作技术，为通过基因修饰改造蛋白质提供了工具。
蛋白质工程的诞生的标志
1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering‘’ (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为 蛋白质工程诞生的标志。
蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：以蛋 白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过 有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、 构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、 更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
蛋白质工程制药 ：EPO的改造
主讲人：Dr. 张杰
蛋白质工程简介 (PROTEIN ENGINEERING)
序论：蛋白质工程简介
蛋白质工程的含义 蛋白质工程的诞生 蛋白质工程的主要内容和基本目的 蛋白质工程与基因工程的区别 主要参考书
一 蛋白质工程的含义
蛋白质工程 根据蛋白质的精细结构
– The life cycle is very sophisticated – Initial infection transfers genetic material into
host with little membrane disruption. – Late infection stages perturb host membrane
for release of virions – M13 is non-lytic
M13 Structure
Dimensions:
– 6.5nm in diameter – Length dependant on genome but wild type
approximately 930nm – Mass 16.3MD of which 87% comprised of
3 来鲁华教授，女，博士，北京大学化学学院长江特聘 教授，北京大学理论生物学中心常务副主任，分子动态与稳态国 家重点实验室主任，国家重点基础研究发展规划项目首席科学家， 国家杰出青年基金获得者。1984年本科毕业于北京大学化学系， 1989年在北京大学化学系获博士学位。1998-1999年期间为美国加 州大学伯克莱分校伯克莱学者。承担过国家自然科学青年基金， 国家杰出青年基金，攀登计划项目，八六三项目等。获得过国家 自然科学三等奖1次，求是基金会青年科学家奖励，中国科协青年 科技奖等。发表论文近百篇，其中SCI收录论文80余篇。来鲁华教 授从1987年开始从事化学与生物学的交叉研究，特别是生物信息 学研究，在蛋白质结构预测及分子设计方面做过大量工作，近年 的主要工作方向为蛋白质-蛋白质相互作用研究，发展了用于蛋白 质-蛋白质相互作用定量研究的平均势方法。
蛋白质工程则更进一步根据分子设计的方案，通过对天然 蛋白质的基因进行改造，来实现对其所编码的蛋白质的改 造，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的， 具有了人类所需要的优点的蛋白质。天然蛋白质都是通过 漫长的进化过程自然选择而来的，而蛋白质工程对天然蛋 白质的改造，好比是在实验室里加快了的进化过程，期望 能更快、更有效地为人类的需要服务。
和生物活力的作用机制之间 的关系，利用基因工程的手 段，按照人类自身的需要， 定向地改造天然的蛋白质或 设计制造新的蛋白质。
二 蛋白质工程的诞生
一张蓝图 上世纪70年代，特别是80年代初结构生物学揭
示了大量蛋白质分子的精确立体结构及其与复杂生 物学功能的关系，为设计改造天然蛋白质提供了蓝 图 一项工具
4该领域的其他著名学者：北大的顾孝诚, 北方基因中心于军、杨 焕明; 清华的李衍达、饶子和; 军科院贺福初、黄培堂、;协和的 沈岩; 瑞金医院的陈竺、 生化所的丁达夫、 上海生物信息中心 的赵国屏等
六 小结
蛋白质工程的主要内涵及基本目的； 蛋白质工程与基因工程的主要区别。
思考题：酶工程与蛋白质工程有什么区别？
两本书，一个人
1《蛋白质的结构预测与分子设计》 来鲁华著 北京大学出版 社,1993
2《PROTEIN STRUCTURE 》 Section 1.Primary structure, secondary motifs, tertiary architecture, and quaternary organization Jannette Carey and Vanessa Hanley Princeton University Princeton, NJ 08544-1009
三 蛋白质工程的主要内容和基本目的
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能关 系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合 成，对现有蛋白质加以定向改பைடு நூலகம்，设计，构 建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质 更加优良，更符合人类需要的新型蛋白质。
四 蛋白质工程与基因工程的区别
基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内， 并在其中进行表达，它的产品还是该基因编码的天然存在 的蛋白质（第一代）。
提示： 酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用， 借助工程学的手段，应用于生产、生活、 医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技 术。概括地说，酶工程是由酶制剂的生产 和应用两方面组成的。酶工程的应用主要 集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。
蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础， 通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造， 设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、 更加符合人类社会需要的新型蛋白质。
Valery A. Petrenko
b. In 1949 ,has published over 70 papers and has 13 inventions and patents.
Overview
The past 10 years has seen remarkable progress in our understanding of the replication cycle of the M13 phage
protein
Genome:
– Single stranded circular DNA molecule, covalently closed
– Housed in a flexible protein cylinder
M13 Structure
Genome orientation
– 78 Nucleotide hairpin region called the packaging signal located at pVII/pIX terminus
published 35 papers in areas including antibody structure and
evolution, the evolution of repeated DNA sequences, genomics, and the biology of the filamentous phage. It is from his interest in the filamentous phage that the idea of phage display evolved.
M13 Structure
Proteins
– Length of phage cylinder comprises 2700 copies of the 50-amino-acid major coat protein pVIII
– At one terminus:
5 copies of 33 AA residue pVII 5 copies of 32 AA residue pIX
2．两个主要的哺乳动物细胞表达系统
在哺乳动物细胞中有两个基因表达系统可供选择，一是瞬 时表达系统，一是稳定表达系统。 瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段， 其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由 未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表 达的时间相对短，只有48h到7天。 稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月 的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中， 这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。
– At one terminus:
5 copies of 406 AA residue pIII 5 copies of 112 AA residue pVI
M13 Gene Functions
Gene II X V VIII III VI VII IX I IV XI
Function DNA Replication DNA Replication Binding ssDNA Major capsid protein Minor capsid protein Minor capsid protein Minor capsid protein Minor capsid protein Assembly Assembly Assembly
噬菌体显示(Phage display)对EPO分 子片段的筛选
关于噬菌体显示的表达载体 噬菌体显示技术的操作 EPO-EPOR EMP-EBP
George P. Smith
Valery A. Petrenko
George P. Smith
b. in 1941. Bsc. degree in biology in 1963, a Ph.D. in bacteriology and immunology from Harvard University in 1970. After a postdoctoral fellowship with Oliver Smithies at the University of Wisconsin, he joined the faculty of the Division of Biological Sciences at the University of Missouri in Columbia in 1975 as Assistant Professor and since has been promoted to Associate and Full Professor. He has
1983年，美国GENE公司的Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering‘’ (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工 程诞生的标志。(Kevin M. Ulmer ( Science 219:666-671). )
.
ABSTRCT
The prospects for protein engineering, including the roles of x-ray crystallography, chemical synthesis of DNA, and computer modelling of protein structure and folding, are discussed. It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis. Such techniques offer the potential for altering protein structure and function in ways not possible by any other method
思路不同：基因工程是遵循中心法则，从 DNA→mRNA→蛋白质→折叠产生功能，基本上 是生产出自然界已有的蛋白质。蛋白质工程是 按照以下思路进行的：确定蛋白质的功能→蛋 白质应有的高级结构→蛋白质应具备的折叠状 态→应有的氨基酸序列→应有的碱基排列，可 以创造自然界不存在的蛋白质。
五 主要参考书
分子遗传学发展了以定点诱变为中心的基因操 作技术，为通过基因修饰改造蛋白质提供了工具。
蛋白质工程的诞生的标志
1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering‘’ (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为 蛋白质工程诞生的标志。
蛋白质工程的主要内容和基本目的可以概括为：以蛋 白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过 有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、 构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、 更加符合人类社会需要的新型蛋白质。