重组人胰岛素的研究历史与生产工艺

四、重组人工胰岛素
通过基因工程酵母菌E．coli发酵生 产hPI，经后加工形成hI。
4.1菌种制备
提取目的基因 提取质粒 基因重组
将质粒送回大肠杆菌 胰岛素的产生
4.2胰岛素的产生和精制（即菌种的 发酵培养）
重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工 技术在如今已经是炉火纯青。有近百年 的 发酵工程为基础，结合现在的基因工程技 术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程 更是可靠和安全的。
1996 胰岛素类似物
从动物胰岛素到人胰岛素是 胰岛素历史的极大进步，之 后动物胰岛素时代终结。
1987 人胰岛素 1973 单组分胰岛素
1953 长效胰岛素
1946 NPH 胰岛素 1923 动物胰岛素
1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000
胰岛素的生产
从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个 氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体
半合成胰岛素 ----将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为
半合成人胰岛素
重组DNA技术生产人胰岛素
※AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接 ※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素（广泛）
4.3药物检测
这种重组人工胰岛素的检测重点应该是 ① 测定生物活性 ② 效价测定 ③ 控制产品中杂质潜在有害物质 ④ 保证产品安全性和有效性
五、问题与展望
胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位， 但因注射给药让许多患者产 生畏惧心理，使其作 用发挥受到限制。
研究方向： 1.新的给药方式，例如:口服、吸入; 2.改变药物代谢机制; 3.改进注射手段，让使用者无痛; 这是国际国内胰岛素类药物研究发展的前沿和趋势。
P1沉淀、干燥：调节PH值，使P1沉淀，再经离心 干燥，得中间体I固体 控温进行转肽反应，主要 试剂为DMSO与1,4-丁二醇
P2纯化：再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异 丙醇
P2沉淀、干燥：调节PH值，使P2沉淀，再经离心 干燥，得中间体II固体
具体步骤
脱帽：通过控制湿度与温度进行脱帽反应，得到 终产物胰岛素 主要试剂为丙酮，产品为半固体
发酵罐培养：分两阶段进行控制，第一阶 段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌体达 到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使 菌体进行高密度表达目的产物，HPLC检测 目的产物含量
具体步骤
发酵液固液分离：目的产物存在于发酵液上清液 中，此步骤主要控制目的产物回收率
P1纯化：通过两步柱层析，主要试剂为乙醇与异 丙醇，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白， 利用紫外检测仪控制目的产物回收率
1970s----单峰胰岛素和 单组分胰岛素
70年代末----半合成胰岛素
1982年----采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。
90年代至今----重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效 和长效人胰岛素类似物。
胰岛素的发展史
到1987第一支人胰岛素问 世，并于同年应用于人，因 为与人的天然胰岛素氨基酸 序列完全相同，所以抗原性 大大降低。
美国的礼来公司已经获准大规模工业化生 产胰岛素
诺和诺德制造的胰岛素开始在市场上大量 销售
法国赛诺菲安万特全球第一个生产甘精胰 岛素类似物的企业
通化东宝中国最大的重组人胰岛素生产厂 家
此外，还有甘李药业、江苏万邦、联邦制 药等
三、胰岛素制备工艺
以动物胰脏为原料提取胰岛素
----酸醇提取法
※传统胰岛素---猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶 ※单峰胰岛素----凝胶过滤纯化 ※单组分胰岛素---凝胶过滤、离子交换纯化
成品粗纯化：经过两步柱层析对胰岛素进行提纯， 试剂为Tris-HCl和异丙醇 通过超滤对提纯后的胰 岛素进行浓缩，通过管道传递到下工序
成品精纯化：通过制备色谱对胰岛素粗品进行精 制，主要试剂为色谱乙腈 然后经两步结晶后通过 管道过滤除菌到百级区
过滤冻干：对胰岛素成品进行一次结晶和水洗 对 水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛 素成品
3D Structure of Insulin
胰岛素二聚体（dimer）
胰岛素六聚体（hexamer ）
二、胰岛素的研究历史
1921年----由加拿大人F.G.班廷和C.H.贝斯特从动物胰腺中提取出胰岛素， 开创了人类胰岛素治疗的历史。
1926年----重结晶胰岛素
1930s----传统中、长效动物胰岛素
发酵培养流程见下图表：
发酵培养流程
菌种扩培 种子罐培养 发酵罐培养 发酵液固液分离 P1纯化 P1沉淀、干燥
P2纯化 P2沉淀、干燥 脱帽 成品粗纯化 成品精纯化 过滤冻干
具体步骤
菌种扩陪：菌种库中取出菌种进行活化及 初步扩大培养
种子罐培养：在种子罐中进一步的扩大培 养，至菌种到对数生长期时转入发酵罐培 养
讲解内容
一、胰岛素简介
二、胰岛素研究历史
三、胰岛素制备工艺

四、重组人胰岛素
4.1菌种制备
4.2胰岛素的产生和精制（即菌种的
发酵培养）
4.3药物检测
五、问题与展望
一、胰岛素简介
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外 源性物质刺激而分泌的一种蛋白质激 素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的 激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病 治疗。作用机理属于受体酪氨酸激酶 机制。