第三章基因工程制药567节
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度、稀释速率、提高溶氧） • 培养基中添加物质（甲硫氨酸和酵母提取物） • 基因工程（携带氧能力的VHB蛋白基因、使用
磷酸乙酰化酶缺陷株） • 改变培养方式-透析培养
第三章基因工程制药567节
二、菌体生长与前体供应的关系
在基础培养基中加入氨基酸（小分 子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白 合成增加。
培养条件的改变（营养成分、dO2、 补料或稀释速率、温度等），会改变 菌体的能量代谢和小分子前体的供应， 影响生物大分子的合成和菌体的生长。
第三章基因工程制药567节
一、菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量
大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生 代谢副产物乙酸，导致培养基的pH值下降， 从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少 乙酸的抑制作用
第五节 基因工程菌的稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
第三章基因工程制药567节
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比 例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
这种菌与带质粒的菌相比具有生长优势， 因而减少了基因表达的产率。
第三章基因工程制药567节
• 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌 频率低，但大量外源质粒的存在使含质 粒菌的比生长速率明显降低，而一但不 含质粒菌产生，便成为优势菌株，对质 粒的稳定性不利。
第三章基因工程制药567节
菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。 高比生长速率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
数质 1
950
粒
拷
贝
3 0.5
×10
40
0
0.2
0.4
生长速率/h
β-半乳糖苷酶工程菌JM103(pUC8)的连续养
第三章基因工程制药567节
• Betenbaugh将质粒复制必需的RepA蛋白 克隆在PR启动子的下游，质粒拷贝数受温 度诱导，诱导后质粒浓度从60μg／g细胞增 加到l,900μg／g细胞，从而增加了基因拷 贝数，使外源基因的表达明显增加。
第三章基因工程制药567节
• 例子：对表达干扰素αa的大扬杆菌 W3110(pEC901)在不同比生长速率下 的质粒稳定性随着稀释率的增加，质粒 稳定性明显增加，干扰素的比效价也明 显增大。
第三章基因工程制药567节
提高质粒稳定性的方法？？
• 选择合适的宿主菌与载体 • 增加质粒的拷贝数 • 分两阶段培养工程菌 • 选择压力 • 改变发酵条件 • 改变细胞的稀释速率 • 改变培养方式 （固定化培养）
第三章基因工程制药567节
第六节 基因工程菌生长代谢的特点
菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源、控
制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生 长。
控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、 减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产 率有重要意义。
第三章基因工程制药567节
大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是 基本恒定的，因而菌体的生长速度也 反映了蛋白质的合成速度。
基因工程菌质粒的表达需与宿主细 胞竞争共同的前体和催化结构，加剧了 这些成分的不足，特别是工程菌诱导后， 外源基因的大量表达，引起工程菌比生 长速率降低，甚至生长停滞。
第三章基因工程制药567节
质粒存在对菌体代谢的影响：
Birnbaun发现，中等拷贝质粒（56拷贝）的工程 菌中，一些酶与前体合成有关的酶的相对水平 增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，菌体 比生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工 程菌大量前体被利用，引起前体不足，从而产 生“严紧反应”有关。
10-12h
含抗性标记抗生素
100个菌落 平 板 培 养 基
10-12h
统计生长菌落数
重复三次, 计算比值, 该比值反应了质粒 的稳定性
(稳定性 stability，ST)
第三章基因工程制药567节
二、提高质粒稳定性的方法
为了提高质粒稳定性，工程菌培养 采用两阶段培养法（分阶段控制培养）：
⑴先使菌体生长到一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达 • 选择合适的宿主菌与合适的载体
第三章基因工程制药567节
在培养基中加入选择性压力（抗菌素）抑 制质粒丢失菌的生长，是提高质粒稳定性 的常用方法。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和 溶解氧浓度可使工程菌生长速率具有优势。
第三章基因工程制药567节
有些含质粒菌对发酵环境的 改变比不含质粒菌反应慢，间歇改 变培养条件以改变两种菌比生长速 率，可改善质粒稳定性。通过间歇 供氧和改变稀释速率，都可以提高 质粒稳定性。
第三章基因工程制药567节
Δ分批培养中选择不同的碳源、补料 培养中控制补料速度、连续培养中 控制稀释速率等都能在一定范围内 控制菌体的生长，从而控制乙酸的 产生，减少它产生的抑制作用。
第三章基因工程制药567节
ΔHan等发现在基本培养基中加入甲硫氨 酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
甲硫氨酸提高了菌体的有氧代谢能力；而 酵母提取物在提高比生长速率的同时， 能使菌体减少对葡萄糖的摄取，从而减 少乙酸的产生。
第三章基因工程制药567节
• 但是在高拷贝质粒菌中质粒拷贝数增加与 产物增加往往不成正比，这可能是由于含 高拷贝质粒的菌中，蛋白合成的限速步骤 是转录和翻译，基因的大量复制加重了转 录和翻译的负担，使其速度减慢。
第三章基因工程制药567节
稀释
样品
质粒稳定性的分析
不含抗性标记抗生素
平 板 培 养基
第三章基因工程制药567节
通过基因构建解决 Beiley报道，在大肠杆菌中克隆具有携带氧能
力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率， 减少乙酸的产生。 Bauer采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞， 阻止了乙酰辅酶A转化为乙酸，提高蛋白的 产量。
第三章基因工程制药567节
减少发酵过程中乙酸副产物的影响途径？ • pH值 • 发酵控制（碳源、控制无机磷的浓度、补料速
第三章基因工程制药567节
一、质粒不稳定产生的Baidu Nhomakorabea因
工程菌的质粒不稳定常见的是分裂不稳 定，它主要与两个因素有关：
⑴ 含质粒菌产生不含质粒子代菌的 频率；
⑵ 这两种菌的比生长速率差异的大小。
第三章基因工程制药567节
对同一工程菌，控制不同的比生 长速率可改变质粒的拷贝数：
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率高，增加工程菌中质粒 拷贝数可提高质粒稳定性；
磷酸乙酰化酶缺陷株） • 改变培养方式-透析培养
第三章基因工程制药567节
二、菌体生长与前体供应的关系
在基础培养基中加入氨基酸（小分 子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白 合成增加。
培养条件的改变（营养成分、dO2、 补料或稀释速率、温度等），会改变 菌体的能量代谢和小分子前体的供应， 影响生物大分子的合成和菌体的生长。
第三章基因工程制药567节
一、菌体的生长与能量的关系
碳源物质是组成培养基的主要成分。 碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量
大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生 代谢副产物乙酸，导致培养基的pH值下降， 从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少 乙酸的抑制作用
第五节 基因工程菌的稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
第三章基因工程制药567节
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比 例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或 碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
这种菌与带质粒的菌相比具有生长优势， 因而减少了基因表达的产率。
第三章基因工程制药567节
• 高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌 频率低，但大量外源质粒的存在使含质 粒菌的比生长速率明显降低，而一但不 含质粒菌产生，便成为优势菌株，对质 粒的稳定性不利。
第三章基因工程制药567节
菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。 高比生长速率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。
数质 1
950
粒
拷
贝
3 0.5
×10
40
0
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0.4
生长速率/h
β-半乳糖苷酶工程菌JM103(pUC8)的连续养
第三章基因工程制药567节
• Betenbaugh将质粒复制必需的RepA蛋白 克隆在PR启动子的下游，质粒拷贝数受温 度诱导，诱导后质粒浓度从60μg／g细胞增 加到l,900μg／g细胞，从而增加了基因拷 贝数，使外源基因的表达明显增加。
第三章基因工程制药567节
• 例子：对表达干扰素αa的大扬杆菌 W3110(pEC901)在不同比生长速率下 的质粒稳定性随着稀释率的增加，质粒 稳定性明显增加，干扰素的比效价也明 显增大。
第三章基因工程制药567节
提高质粒稳定性的方法？？
• 选择合适的宿主菌与载体 • 增加质粒的拷贝数 • 分两阶段培养工程菌 • 选择压力 • 改变发酵条件 • 改变细胞的稀释速率 • 改变培养方式 （固定化培养）
第三章基因工程制药567节
第六节 基因工程菌生长代谢的特点
菌体的生长通常用比生长速率来表示。 工程菌培养可通过选用不同的碳源、控
制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生 长。
控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、 减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产 率有重要意义。
第三章基因工程制药567节
大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是 基本恒定的，因而菌体的生长速度也 反映了蛋白质的合成速度。
基因工程菌质粒的表达需与宿主细 胞竞争共同的前体和催化结构，加剧了 这些成分的不足，特别是工程菌诱导后， 外源基因的大量表达，引起工程菌比生 长速率降低，甚至生长停滞。
第三章基因工程制药567节
质粒存在对菌体代谢的影响：
Birnbaun发现，中等拷贝质粒（56拷贝）的工程 菌中，一些酶与前体合成有关的酶的相对水平 增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。 高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，菌体 比生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工 程菌大量前体被利用，引起前体不足，从而产 生“严紧反应”有关。
10-12h
含抗性标记抗生素
100个菌落 平 板 培 养 基
10-12h
统计生长菌落数
重复三次, 计算比值, 该比值反应了质粒 的稳定性
(稳定性 stability，ST)
第三章基因工程制药567节
二、提高质粒稳定性的方法
为了提高质粒稳定性，工程菌培养 采用两阶段培养法（分阶段控制培养）：
⑴先使菌体生长到一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达 • 选择合适的宿主菌与合适的载体
第三章基因工程制药567节
在培养基中加入选择性压力（抗菌素）抑 制质粒丢失菌的生长，是提高质粒稳定性 的常用方法。
调控环境参数如温度、pH、培养基组分和 溶解氧浓度可使工程菌生长速率具有优势。
第三章基因工程制药567节
有些含质粒菌对发酵环境的 改变比不含质粒菌反应慢，间歇改 变培养条件以改变两种菌比生长速 率，可改善质粒稳定性。通过间歇 供氧和改变稀释速率，都可以提高 质粒稳定性。
第三章基因工程制药567节
Δ分批培养中选择不同的碳源、补料 培养中控制补料速度、连续培养中 控制稀释速率等都能在一定范围内 控制菌体的生长，从而控制乙酸的 产生，减少它产生的抑制作用。
第三章基因工程制药567节
ΔHan等发现在基本培养基中加入甲硫氨 酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
甲硫氨酸提高了菌体的有氧代谢能力；而 酵母提取物在提高比生长速率的同时， 能使菌体减少对葡萄糖的摄取，从而减 少乙酸的产生。
第三章基因工程制药567节
• 但是在高拷贝质粒菌中质粒拷贝数增加与 产物增加往往不成正比，这可能是由于含 高拷贝质粒的菌中，蛋白合成的限速步骤 是转录和翻译，基因的大量复制加重了转 录和翻译的负担，使其速度减慢。
第三章基因工程制药567节
稀释
样品
质粒稳定性的分析
不含抗性标记抗生素
平 板 培 养基
第三章基因工程制药567节
通过基因构建解决 Beiley报道，在大肠杆菌中克隆具有携带氧能
力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率， 减少乙酸的产生。 Bauer采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞， 阻止了乙酰辅酶A转化为乙酸，提高蛋白的 产量。
第三章基因工程制药567节
减少发酵过程中乙酸副产物的影响途径？ • pH值 • 发酵控制（碳源、控制无机磷的浓度、补料速
第三章基因工程制药567节
一、质粒不稳定产生的Baidu Nhomakorabea因
工程菌的质粒不稳定常见的是分裂不稳 定，它主要与两个因素有关：
⑴ 含质粒菌产生不含质粒子代菌的 频率；
⑵ 这两种菌的比生长速率差异的大小。
第三章基因工程制药567节
对同一工程菌，控制不同的比生 长速率可改变质粒的拷贝数：
低拷贝质粒工程菌产生不含质粒 子代菌频率高，增加工程菌中质粒 拷贝数可提高质粒稳定性；