第九章 生物芯片及数据分析技术

蛋白分子相互作用分析
常用数据库： • STRING 、pSTIING等
String9.05在线分析
pSTIING在线分析
单基因分析
常用数据库： • 美国国家生物技术信息中心（NCBI） • 欧洲生物信息研究所（EBI）
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片（Prochip）
——与DNA芯片比较类似，只不过蛋白质芯片利用的 是抗原/抗体、配基/配体（或受体）等蛋白质之间的相互作 用。
人类基因组计划
人类基因组计划（human genome project, HGP）是 一项国际性科学研究计划，旨在阐明人类基因组30 亿个碱基对的序列，从物理和功能角度发现和定位 人类基因组基因，破译人类全遗传信息，使人类第 一次在分子水平上全面地认识自我。 对人类基因组的研究推动了整个生命 科学的发展，同时也形成一门崭新的 科学——基因组学（genomics），即 研究基因组的科学。
人类基因组计划主要研究内容
以具有遗传多态性的遗传 以一段已知核苷酸序 标记为位标、以遗传学距离为 列的DNA片段（称为序列 图距的基因组图。 核苷酸序列图即最详尽的物 标签位点，sequence tagged 理图。通过测序得到基因组 site，STS）为位标，对构 遗传学距离以厘摩 的序列，是一般意义上的人 成基因组的DNA分子进行 （centi-Morgan, cM）表示。 类基因组计划。 测定，从而对某段DNA 序 连锁的遗传标志之间的重组频 列在染色体上的相对位置 率为1% 时，它们的相对距离 做一线性排列。 为1cM， 相当于106 bp(1Mb)。 以kb或Mb作为图距而 绘制的基因组图。 遗传多态性标记为： RFLP、MS/STR、SNP。
生物芯片
芯片实验室（Lab-on-a-chip）：生物芯 片技术发展的最终目标。
——把生物、化学等领域中所涉及的样品制备、生物化学反应、分离检测等 基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的 生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。
生物芯片技术流程
第一节 DNA芯片（DNA chip）
又称为基因芯片（Gene chip）或 DNA微阵列（DNA Microarray）。 将大量已知的探针（寡核苷酸片段或DNA片段）固定于 支持物上，然后与标记的样品DNA按碱基互补配对原则进 行杂交（探针能够在基因混合物中识别出特定基因），最 后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定基因进行分析。
考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、 探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结 构的影响。
利用生物素标记的，在此染色（常用抗生蛋白链菌素-藻蓝蛋白 ）
④ 检测分析
——利用专门的芯片扫描仪对杂交结果进行图象采集和 分析。
荧光标记阳性杂交图
基因芯片检测结果
不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记 的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫
• 原理：分子间特异性相互作用
• 核酸杂交 • 抗原－抗体作用 • DNA－蛋白质间的识别作用等
特点：
①
② ③ ④ ⑤
高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子）
微型化（可装入口袋） 自动化（技术自动化；结果分析
自动化）
低成本（相对于同时进行大量分
子研究而言）
防污染
分类：
DNA芯片（基因芯片） 微阵列芯片 蛋白质芯片 组织芯片 细胞芯片
表达谱芯片是DNA芯片中最常用的一种芯片。
Affymetrix基因表达谱芯片的实验流程
生物信息学分析
——基因芯片读数实际上是扫描后的信号强度，是一种相 对值。不同芯片之间要经过以看家基因作为对照的标准 化处理才有可比性。
常用GAPDH 或β-actin基因
归一化的数据
1、差异基因的筛选
倍数差异FoldChange=SignalA/SignalB（即待比 较的两个标准化以后的信号相除所得的值） ——常用标准Ratio（0.5，2.0）
视图分析
散点图（Scatter plot）
火山图（Volcano plot）
聚类分析将基因与最相关的表达谱放在一起，分析的
基础是总基因组的线性相关。生物系统的有序性质可以保证聚 类分析方法会揭示出生物行为的有趣特征。
GO（Gene Ontology）分析
——寻找不同样品的差异基因可能和哪些基因功 能的改变有关。
利用DNA芯片进行杂交测序的原理
• 杂交测序技术（SBH）可大规模地检测和分
析DNA的变异及多态性。
突变
疾病诊断
1、用于诊断遗传性疾病
例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫血的检测芯片
2、用于病原体的检出和确定
例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出 多种引起呼吸道感染的病原体。
3、肿瘤的基因诊断
——包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信 号传递、细胞周期，及同系保守的子通路等信息 常用数据库：
•
DAVID、BIORAG（Bio
Resource for Array Genes）等
表 健脾益气法相关差异基因信号通路分析（DAVID 6.7）
深入分析：涉及Gq蛋白激活的花生四烯酸HETEs代谢通路
1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜
2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定 在支持物上，每个位点的序列是已知的
DNA microarrays on glass slides
② 样品制备（DNA、mRNA）
——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污 染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。 常用标记物： 生物素 荧光素 对照样品（Cy5-dUTP） 待测样品（用Cy3-dUTP 标记）
上世纪70年代，美国投入巨资的“肿瘤计划”搁浅，人们 渐渐认识到，包括癌症在内的各种人类疾病都与基因直接 或间接相关。 1984年，美国能源部（DOE）首次探讨人类基因组DNA进行 全序列分析的前景 1986年美国生物学家、诺贝尔奖获得者杜尔贝科(R. Dulbecco) 在《science》发表《癌症研究的转折点—— 测定人类基因组序列》（“人类基因组计划的标书” ） 得到热烈响应。 1990年10月1日，人类基因组计划正式启动。 2001年2月，人类基因组序列“工作框架图”公布 2006年5月，最后一条染色体序列被公布 2008年1月，个人基因组计划启动
显著性差异p值：进行统计学t检验，p<0.05为显 著性差异，p<0.01为强显著性差异 ——生物学重复不少于3个
每个探针点的Flag值/Call值：表达谱芯片中常用A、 P、M来表示该探针点信号与背景信号的差异 ——A-Absent：无显著性差异 P-Present：有显著性差异 M-Marginal：差异介于A和P之间 ——要求比较的两组，至少有一组内不出现A
分子间的反应
• 主要有： ①抗原抗体反应 ②蛋白质分子与其它蛋白分子或与核酸分子之 间的特异性识别结合 ③酶与底物的识别等 • 通过优化合适的反应条件使生物分子间反应处 于最佳状况中，可以减少生物分子之间的错配 比率。
蛋白质芯片信号的检测
• 对吸附到蛋白质芯片表面靶蛋白的检测主要有两 种方式 ： 1、以质谱技术为基础的直接检测法〈如表面增强激 光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELDI - TOF MS)〉 2、蛋白质标记法： ①荧光标记的芯片既可用激光共聚焦检测，也可用 电荷偶联照像系统（CCD）进行检测 ②酶标芯片显色后用高精度的CCD进行检测 • 常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中， 通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱，再经 相关软件分析图像,即可以获得有关生物信息。
蛋白质芯片在医学中的用
• • • • 特异性抗原抗体检测 酶活性等生化反应检测 临床检验和疾病诊治 毒理学研究、药物筛选等
以表达谱芯片为例： I. 提取样本组织细胞中的mRNA（样本要新鲜并有代表性） II. 对提取的mRNA进行纯化 III. 逆转录合成cDNA（可进行PCR以提高灵敏度） IV. 以双链cDNA为模板进行体外转录（荧光标记在此渗入）
③ 分子杂交
——是已标记的样品与芯片上的探针进行反应后产生一系 列信息的过程。 与传统的核酸分子杂交相同，但要求更高： 选择合适的反应条件、减少生物分子之间的错配率。
DNA芯片实验流程
• 基本环节： 芯片制作 样品制备 分子杂交 检测分析
① DNA芯片制作
就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针通 过一定的方法固定到固相支持物上。 主要有两种：原位合成法和直接点样法
原位合成法和直接点样法的比较
DNA芯片的基本构造
探针 支持物
外观
剖面图
平面局部放大
分类： • 分子功能（Molecular Function） • 生物过程（biological process） • 细胞组成（cellular component）
常用数据库：
•
DAVID、GATHER、PANTHER等
表 健脾益气法相关差异基因GO分类（DAVID 6.7）
KEGG pathway分析
4 CGTTAGAT 4 ACGTTAGA 33 TACGTTAG ACGTTAGA 5 GTTAGATC 1 ATACGTTA 3 TACGTTAG 4 2 5 ACGTTAGA CGTTAGAT GTTAGATC 计算机分析杂交图象 并由探针的重叠情况 推导样品的核酸序列 互补序列为：ATACGTTAGATC 样品序列为：TATGCAATCTAG
DNA芯片技术的应用
DNA测序：杂交测序（SBH） 疾病诊断：寻找和检测与疾病相关的基因 及在RNA水平上检测致病基因的表达 用药个体化分析： 药物筛选： 基因表达研究：
DNA 样 品 TATGCAATCTAG 与基因芯片上 65,000 种可能的 八聚体进行杂交从而形成特定 的结合图形 1 ATACGTTA CGTTAGAT 22 GTTAGATC
例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针 集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发 挥作用。
药物筛选
• 利用DNA芯片技术可比较正常组织（细 胞）与病变组织（细胞）中大量相关基 因表达的变化，从而发现一组疾病相关 基因作为药物筛选靶标片
蛋白质芯片与DNA芯片的差异：
① 制备时的配基不同、固定条件不同 ② 点样密度不同
③ 结合反应的原理不同
④ 检测方法基本相同 ⑤ 应用方向不同
蛋白质芯片探针及其标记
• 根据研究目的不同，蛋白芯片的探针可选 用某些特定的抗原、抗体、酶和受体等。 • 探针的标记主要有：
酶标记（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP） 荧光标记（常用Cy3和Cy5） 化学发光物质标记（如吖啶酯）等
对核酸序列分析与测定提出的新要求
• 速度快、效率高 • 高通量（可同时对大量核酸序列进行检测和分析）
• 操作简便、自动化程度更高
• 成本低
• 生物芯片技术正是在这样的背景下应运 而生。
生物芯片技术
• 定义：是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大
量生物大分子如核酸片段、多肽分子、糖类甚至组织切 片和细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅 片、滤膜等载体）的表面，组成高度密集的二维分子排 列，然后与已标记的待测生物样本中的靶分子杂交，通 过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效 地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。
人类基因组计划催生了大量生物数据
GeneBank数据的快速增长
怎样去研究如此众多基因的生物信息及其 在生命过程中所担负的功能，成了全世界 生命科学工作者共同的课题！
传统核酸印迹杂交的局限性
• 传统核酸印迹杂交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 • 技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、 低通量(low through-put)等
第九章 生物芯片及数据 分析技术
在20世纪科技史时有两件事是值得大书特书的： （1）微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏 ，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入到每个 家庭； （2）DNA芯片，它将改变生命科学的研究方式， 革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水 平。 ——美国《财富》杂志