转基因动物制备的方法的[知识荟萃]

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1984年，Bradley证实注射入囊胚的小鼠ES细胞可分化为 成体的各种组织，并整合入生殖系。 意义：里程碑，与同源重组技术的结合使得在整体水平 定向改变和修饰哺乳动物的遗传特性成为可能。 1995年，Thomson从恒河猴中分离了猴的ES细胞； 1998年，Thomson从人的囊胚中分离成功人的ES细胞； 2000年，Bongso等建立了人的ES细胞株
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缺点：
设备昂贵、环节较多 对操作人员有较高的技术要求 低效率（尤其是大家畜） 对卵子伤害大，胚胎存活率低 基因整合随机性 转基因沉默
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2. 2 精子载体介导法
• 将精子反复冷冻或经过化学物质处理后 与外源 DNA 共同孵育 ,从而使外源DNA 与 精子结合 ,然后通过人工授精得到转基因个 体
转基因动物的制备方法
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•
1 转基因动物的概念
转基因动物就是指用试验的方法将人 们所需要的外源基因导入到动物体内 ,使 这种外源基因与动物本身的染色体整合在 一起 ,这样外源基因就能随着细胞的分裂 而增殖 ,在动物体内得到表达 ,并且能够稳 定遗传给后代的动物。
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与显微注射法的比较
方式 DNA长度
与时相 移卵部位 整合方式
表达
传代
显微注射法 ＜50kb, 单细胞卵 输卵管
随机，多拷贝 受宿主旁侧的DNA影响
可以
逆转录病毒法 ＜10-15kb, 4-6细胞卵 子宫
细胞含有目的基因 ,将嵌合体连续与正常动物进行
交配 ,就会得到转基因动物。
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ES细胞技术发展历史
1956年，Whitten培养成功小鼠的受精卵，在体外发育成囊胚； 1958年，McLaren经胚胎移植，体外培养的胚胎产生小鼠个体； 1965年，Brinster建立了胚胎的微滴培养技术； 1968年，Gardner将分离的细胞注入囊胚，获得嵌合鼠; 1970年，Steven分离成功小鼠的胚胎瘤细胞； 1981年， Martin Evans 从正常的小鼠囊胚中分离成功ES细胞；
• 目前国际上极少成功模型，国内也很少 有相关报道，精子载体法很少被应用。
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体外受精法 & 胞质内显微注射法
• 体外受精法是一种直接用精子作为外源 DNA 载体的转基因方法 ,其过程是将成熟的 精子与外源 DNA 进行预培养 ,因为在一定 条件下 ,精子核后帽区有自发结合 DNA 的 能力 ,因此 ,精子能够携带外源 DNA进入受 精卵 ,并使之受精 ,从而使外源 DNA 整合到 受体染色体中而得到转基因动物。
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• 转基因动物自产生以来 ,随着研究的不 断深入 ,近些年来得到了迅速的发展。由于 它打破了自然繁殖中的种间隔离 ,使基因能 在种系关系很远的机体间流动 ,实现了动物 种间遗传物质的交换与重组 ,这不仅为遗传 物质的研究提供了新的手段 ,丰富了物种的 基因库 ,而且扩大了生命科学的视野。
•
逆转录病毒是第一个用于基因转移的病毒载
体。
•
将目的基因整合到逆转录病毒的 RNA 载体
上 ,制成高滴度的病毒颗粒 ,人为感染着床前或着
床后的胚胎 ,RNA 病毒感染宿主细胞后反转录成
相应的DNA ,并在整合酶和其末端特殊核酸序列
的作用下整合到宿主细胞的基因组中进行表达和
遗传得到转基因动物。
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• 转基因动物是动物基因工程在医学生物 学研究中的突出成果。
• 近十年来，为分子遗传学、发育生物学、 医学遗传学、肿瘤研究及优良经济动物的 开发研究等多方面做出了很大的贡献。
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Gordon 等人首次成功地将含有HSV 和 SV40DNA 片段的重组质粒DNA 以显微注射法导 入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源 DNA 顺序的TGM 。
1982 年Palmiter 等运用此法得到的所谓“超 级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。
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到目前为止，人类已获得转基因鱼、 鼠、羊、猪、兔、牛等大小动物。
从转基因动物所获得的资料几乎涉及医 学遗传学、肿瘤学、免疫学等的基因研 究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的 开发研究等。
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2 转基因动物的制备方法
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2. 1 显微注射法
• 也称原核显微注射法 ，是发展最早、使用最为 广泛的转基因方法之一。
• 利用显微操作技术将外源基因直接注射到试验动 物的受精卵中，注射的外源基因与胚胎基因组融 合，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受 精卵移植到受体子宫内发育，这样分娩的动物体 内的每一个细胞都含有外源 DNA 片段。
……
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优点：
外源基因整合情况的可控性高。
可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、 定位、表达的水平及插入的稳定性。
外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴 定及筛选方便。
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缺点：
ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
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2. 4 逆转录病毒感染法
有分化成3种胚层的发育潜能。
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通过一定的方法将外源基因导入到 ES ,外源
基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到 ES
基因组中 ,再以显微注射法把这种转基因胚胎干细
胞植入正常发育的囊胚中 ,然后将囊胚移植到受体
动物的子宫内 ,由于胚胎干细胞参与了胚胎生殖系
的发育 ,所以所产生的嵌合体其生殖细胞中一部分
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2. 3 胚胎干细胞介导法
•
干细胞（stem cells）：是细胞谱系分化中最
原始的细胞，能终身自我更新，并具有多分化潜能，
能增殖分化为特定的组织细胞。
•
胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）：
从着床前的哺乳类胚胎中分离的多能干细胞，具有
在体外不分化的增殖能力，经体外长期培养后仍具
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以使用较多的小鼠为例，这一方法的实 验程序如下：
• ⑴ 准备假孕母鼠（养母） • ⑵ 受精卵的准备 • ⑶ 基因导入 • ⑷ 胚胎移植 • ⑸ 对幼鼠的鉴定
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优点：
外源DNA大小基本不受限制(1-50kb) 导入过程直观 整合率高
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