食品中铜绿假单胞菌检测.

• 铜绿假单胞菌的菌体形态
无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色， 革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动 活泼。菌体的大小为0.5～1µm×1.5～ 3.0µm，菌体笔直或弯曲。
三、铜绿假单胞菌的检测
（一）检测方法（滤膜法） （二）检测原理 （三）试剂和设备 （四）检测步骤 （五）报告
（一） 铜绿假单胞菌检测方法 （滤膜法）
阴性
阳性
（3）金氏B培养
将纯化后呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的 培养物接种于金氏B培养基上于36℃±1℃培 养 24h～5d。每天需取出在紫外灯下检查其 是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记 录为阳性。
（3）金氏B培养
阴 性
阳性
日光下观察
阳性
阴性
荧光下观察
（4）产氨试验
将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中 ，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每 支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各 试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红 色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性 。
红褐色菌落数； CR — 产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳
性的红褐色菌落数。
计算举 例
N=20+15×(2/5)+10×(3/5)=32 – 20：呈蓝/绿色的菌落数； – 15：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； – 2：产氨阳性的显荧光菌落数； – 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； – 10：呈红褐色的菌落数； – 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均
5. 确证性试验
（1）营养琼脂纯化 （2）氧化酶试验 （3）金氏B培养 （4）产氨试验
（1）营养琼脂纯化
• 将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培 养基上，于36℃±1℃培养 20h～24h，对 可疑菌落进行纯化。
（2）氧化酶试验
将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验，取2～3滴 新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸 上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养 物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的 视为阳性反应。
水样过滤
3. 培养
将平板置于36℃士 1℃恒温箱中培养48h， 并防止干燥。
4、结果观察
培养20h～24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数，防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。
（ 40h～48h时更容易观察产色素情况和荧光 情况）。
ATCC27853阳性对照菌株结果观察
24h培养结果（阳性）
删除了菌落总数指标； 保留了大肠菌群； 增加了铜绿假单胞菌这一指标 。 国家标准要求：0 CFU/250ml
二、铜绿假单胞菌的致病性
铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的主 要病原菌之一。
可引起局部化脓性炎症，也可引起中耳炎、角膜 炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎 ，还可引起败血 症菌血症及婴儿流行性腹泻。
呈阳性的红褐色菌落数； – 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测
试的红褐色菌落数。
（五）报告
结果以 CFU/250ml计。 国家标准要求：0 CFU/250ml
注意：若样品污染严重，建议对样品进行 稀释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。
课堂测验
1. GB19298-2014《包装饮用水》的微生物指标中， 增加了 的检测，删除了 的检测。
A.菌落总数 B. 大肠菌群 C. 铜绿假单胞菌 D.霉菌
2. 铜绿假单胞菌可引起局部化脓性炎症，也可引
起
。
A.中耳炎 B.角膜炎 C.胃肠炎 D.以上都是
3.下列
不是铜绿假单胞菌的检测试剂。
患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者或术后 治疗的患者易感染本菌。
烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。
主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、 胞外酶和外毒素等多种致病因子。
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆
菌，因为在代谢过程中产生水溶性的绿色 色素，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆 菌。
（四）检测步骤
1. 检验程序 2. 水样过滤 3. 培养 4. 结果观察 5. 确证性试验 6. 计数 7. 结果报告
1. 检验程序
蓝/绿色菌落
红褐色菌落
铜绿假单胞菌阳性 铜绿假单胞菌阳性 铜绿假单胞菌阳性
2、水样过滤
在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。
7.结果说明
• 菌落计数公式： N＝P＋F(CF/nF)＋R(CR/nR)
P — 呈蓝/绿色的菌落数； F — 没有绿脓色素但显荧光的菌落数； R — 呈红褐色的菌落数； nF — 进行产氨测试的显荧光菌落数； CF — 产氨阳性的显荧光菌落数； nR — 进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的
一般情况下，铜绿假单胞菌经过水源水消毒、 管道消毒和臭氧消毒后，其活力大大降低， 基本检测不出铜绿假单胞菌。
福建某市桶装天然矿泉水铜绿假单胞菌超标， 到处查找原因，最后发现是蓄水池水（原始 污染源）中含有大量铜绿假单胞菌。停用了 蓄水池的水，产品结果变正常。
如发现污染，请查找污染源，消除污染。
（三）试剂和设备
• 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂 • 营养琼脂 • 金氏B 培养基 • 乙酰胺肉汤 • 氧化酶试剂 • 钠氏试剂
1、检测试剂
1、检测试剂
2、检测材料
2、检测材料
3、 设备和仪器
玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高 压蒸汽灭菌15min
恒温培养箱：36℃±1℃ 紫外灯：波长应为360±20nm 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45μｍ 显微镜：10×～100× 冰箱：0℃～8℃
GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法
（二）检测原理
铜绿假单胞菌的特性： 需氧菌，营养要求不高，产色素(主要为绿脓素) 90 ％以上的菌株产生蓝绿色色素。 98 ％菌株产生水溶性荧光色素。 氧化酶试验呈阳性。 分解乙酰胺产生氨。
（二）检测原理
将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤， 并将滤膜移至CN琼脂选择性培养基上，于36℃士 1℃恒温箱中培养48h，典型菌落能够在CN琼脂选择 性培养基上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼 脂选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光 （360±20nm）照射下能产生荧光、能够利用乙酰 胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假 单胞菌，则其检测结果为阳性。
（4）产氨试验
未加入钠氏试剂
深黄色到砖红色
阳性
阴 性
加入钠氏试剂
6.计数
• 计数滤膜上产绿脓色素的菌落以获得铜绿假单胞菌 的数量。
• 在紫外灯下产生荧光且在乙酰胺肉汤中产氨的所有 菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计数。
•将氧化酶反应阳性、 乙酰胺肉汤产氨、金氏B培养基 上显荧光的红褐色菌落进行计数。
一、检测背景
WHO在HACCP的评估中明确指出铜绿假单胞菌 是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹 泻。
尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜 绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生。
普通人食入103~104个菌体细胞即可被侵害。
一、检测背景
2014年新出台的食品安全国家标准 GB19298-2014《包装饮用水》 其中微生物指标中：
包装饮用水中 铜绿假单胞菌的检测
主要内容
检测背景 铜绿假单胞菌的致病性 铜绿假单胞菌的检测
一、检测背景
目前空气、河流、土壤污染严重，每年有 260万人死于癌症。
云南铬矿、湖南镉大米、宿迁儿童血铅超 标，大运河的水质与二十年前也没法相比
污染的严重，使人们渴望喝到干净的水， 越多的人开始选择瓶装水。
ATCC25922阴性对照菌株结果观察
24h培养结果（阴性）
ATCC27853阳性对照菌株结果观察
48h培养结果（阳性） 菌落融合ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ATCC25922阴性对照菌株结果观察
48h培养结果（阴性）
在CN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤
备注：NT表示不用测试。
荧光观察
紫外光（360±20nm）进行照射
A.CN琼脂 B.乙酰胺肉汤 C.氧化酶试剂 D.革兰 氏染色剂
4. 铜绿假单胞菌检测中可计数的菌落包括——。 A. 蓝绿色菌落 B.产荧光（非蓝绿色），乙酰胺肉汤阳性菌落 C.红褐色，乙酰胺肉汤阳性，氧化酶阳性，金氏B产
荧光菌落 D.以上都是
5.铜绿假单胞菌检测滤膜的孔径——um。 A. 0.22 B. 0.45 C. 1 D. 10
一、检测背景
国内污染情况：
-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.2％～ 23.6％； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6％。
国外污染情况：
-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单 胞菌； -Rosenberg报告德国1.2％～10.2％的瓶装矿泉水 检出铜绿假单胞菌。
铜绿假单胞菌虽然可由多种途径传播，但主要是 通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医 源性感染。
1：2000的新洁尔灭，1：5000的消毒净在5分钟 内均可将其杀死。0.5-1%醋酸也可迅速使其死亡。 青霉素对此菌无效。
因此，医院对烧伤病房、手术器械及治疗器械进 行严格消毒灭菌，可保证无铜绿假单胞菌的污染。