肿瘤分子诊断技术

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癌症有关的现象 染色体不稳定性 癌化的细胞中常见到三倍体和单倍体 染色体的缺失，还有染色体大片段的重排(插 入、重复、缺失、倒转、易位) 染色体之间或染色体本身的交互作用，可能 也参与了细胞基因表达的调控 利用FISH相关技术检测染色体不稳定性 多色荧光FISH (multifluor-FISH) DNA结构不稳定 微卫星不稳定定 异质性丢失
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细胞内信号传递系统( Intracellular signal transduction systems)
RAS家族是信号传递通路G-protein的成份， 藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号 传至核内 蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信号传递蛋白与信 号传递至核内有关 核内转录因子 MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子 细胞周期有关的蛋白 调控细胞周期相关的激酶和激酶抑制物
肿瘤的分子诊断技术
温州医学院检验医学院生命科学学院
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癌症的分子诊断
几乎癌组织都是克隆性增殖 患者的所有癌细胞都起源于单一的癌细胞 大多数癌症不能用单基因遗传方式解释 某些类型的癌症，亲属发生同类肿瘤的风险会增 加，但不表现孟德尔遗传 许多癌症与环境的物理化学因子或生物因子有关
பைடு நூலகம்
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基因芯片在癌症的应用 人类p53基因位于第17号染色体短臂13区1带 (17p13.1)上 全长为20 kb 由11个exon和10个intron组成，编 码393氨基酸 90%以上的点突变位点发生在相对保留的第5-8 exon上 突变热点集中在密码子273、 175、248、245、 249、282等位点上 因p53突变位点复杂， Affymetrix公司将p53基 因exon 5-8可能的突变位点全部点在晶片上，构 建一个p53 GeneChip
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原(致)癌基因 调控生长分化、信号传递、转录因子、细胞周期 生长因子 病毒来源的sis基因与细胞来源的原癌基因-血 小板衍生性生长因子次单位 细胞表面生长因子受体 表皮生长因子受体基因( epidermal growth factor receptor， EGFR) 集落刺激因子1受体(CSF1R)基因相当， CSF1R是一种促进骨髓中多种细胞分裂的生 长因子
食品添加剂 亚硝酸的添加
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细胞周期的调控因素
受细胞周期素及相对应的细胞周期素依赖激酶 (cyclin-dependent kinase，CDK)严格调控
细胞胞周期的每阶段都有一组 CDKs与cyclins 交互作用来调控 CDK的磷酸化及cyclin-CDK抑制剂(CKIs)的 活化都会影响细胞周期
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DNA甲基化与癌症
人体大约有一半的基因含有CpG islands
尤其是持家基因和组织特异性表现的基因
与正常细胞比较，DNA的甲基化在癌细胞上
显示出甲基化型式的异常
肿瘤抑制基因与癌相关基因CpG岛高度甲 基化，癌基因及重复序列低度甲基化
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检测LOH (Loss of heterozygosity ) 染色体基因不正常代表着整个片段基因的 缺失或获得 这片段可能在肿瘤发生有关的基因区域
p53、APC基因位臵的LOH
利用毛细管电泳泳CE检测
有些病毒癌基因的产物与细胞癌基因产物共 存，可能调节癌蛋白活化
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肿瘤抑制基因( tumor suppressor gene) 在遗传学上，癌基因对细胞的作用是显性作用 ( dominant effect) 可抑制oncogene作用的基因，称tumor suppressor gene 抑癌基因的蛋白產物能抑制细胞不正常生长及 抑制细胞癌化 遗传学上一般属于阴性 ( recessive) RB基因 视网膜母细胞瘤( retinoblastoma，RB)，一种 侵犯幼儿视网膜膜的肿瘤 散发性非遗传的类型最常见，会造成单侧眼睛 病变 约1/3的RB病人产生多发性肿瘤，且常造成双眼 的病变，及在同胞兄弟姊妹中可发生同样病变， 家族倾向遗传性
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PCR 扩 增 及 电 泳 后 同一个体的肿瘤组织 与正常组织电泳带相 比较，有两个以上的 位点出现电泳带的增 加、减少或移位者就 诊断为MSI阳性。
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病毒性癌基因 只有少数人类反转录病毒引起人类癌症 HIV 可以促进细胞增殖和增加体细胞突变的 机会，或插入基因组促使邻近基因活化引起 免疫缺陷而间接促进肿瘤的产生 病毒癌基因插入宿主癌化的原因 有些的癌基因产物作用如同细胞癌基因产物 有时插入的病毒癌基因是断裂的，這些断裂 的序列可能是基因内的调控序列
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RB基因的功能 蛋白产物pRb是细胞周期的刹车器 pRb 蛋白发生周期性的磷酸化反应 pRb蛋白在GI期是细胞周期抑制信号的集 合点，这个以pRb蛋白为中心的抑制传导 途径，称为RB传导途径 静止的细胞， pRb没有磷酸化 Gl期之末，在有丝分裂时间是磷酸化的 非磷酸化的pRb在进入S期之前可与几种蛋 白质结合调控细胞周期
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p53基因 抑制肿瘤生长的作用，基因定位在17p ， p53是其分子量(53 kD) 在人类的大肠癌中有70%因失去 p53功能 50%的肺癌、40%的乳癌也因p53去活化而诱 发 人类癌症约有一半起因于p53突变缺陷或失 去作用 发生突变的蛋白质可能原因 两个alleles都发生缺失 一个allele上发生错义点突变，会抑制另 一个正常野生型基因的功能
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蛋白质截短检测(protein truncation test ， PTT ) 检测蛋白质层次上的突变 造成蛋白质翻译后缩短蛋白的原因 单个碱基的插入 缺失产生一个stop codon的无义突变 或移码突变(frameshift mutation) 剪接位点的插入缺失造成剪接位点的改变
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也可以说是复制差错(replication error)，
导致寡核苷酸重复序列长度的改变
使肿瘤细胞基因组不稳定而降低整体细胞忠
实复制DNA的能力
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将肿瘤基因的扩增产物利用标志(绿色)与芯 片杂交 从杂交结果上看杂交探针所出现荧光信号， 最亮点表示所测出的碱基 参照正常野生型这个位点的碱基，就可知有 沒有点的突变
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正常细胞中，p53的量都很低 DNA损伤时，p53就大量增加，造成 生长的停止或细胞凋亡( apoptosis) p53就激活p21蛋白质关闭细胞周期 p21蛋白质是一个CDK 的抑制因子 可结合CDK2、CDK4、CDK6，并抑制它 们的活性 细胞进入S期以前，得以修护受损伤的DNA 若细胞已将进入S期，已不能修护受损伤 的DNA，则p53起动细胞凋亡 这二种功能保持基因组的稳定性，p53称为 基因组保护者(guardian of genome)
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癌症相关基因
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致癌基因(oncogene) 1911年Rous发现的鸡的肿瘤传染因子是一种病 毒，为反转录病毒 癌化作用是因為病毒基因组内特殊致癌基因 (v-onc) 哺乳类的基因组上，也存在有同源的序列 (eonc) 调控胚胎的发展、细胞的增殖、分化和凋亡 调控失常，会使细胞发展为恶性表型，正常 细胞中具有这样潜能的基因称为原(致)癌基 因( proto-oncogene)
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造成癌症的因素列举
遗传因素 一些特殊的基因突变会造成特定的癌症
性别
环境因素 压力 病毒感染 药物 生活方式
乳腺癌以女性为主
石棉、辐射线、抽烟、油烟 持续的工作压力 HPV与子宫颈癌 雌激素替代疗法与乳腺癌 运动不足和不当饮食
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微卫星不稳定MSI 正常组织STR相比较，出现STR重复次数的增加或减 少，得到不一样的pattern Microsatellite DNA markers 广泛使用在检测肿瘤 初期基因组不稳定现象 Mao et al.(1996) ， 使 用 microsatellite analysis检测膀胱癌的尿沉淀物，有95%的检出率 杂合性性丢失( loss of heterozygosity、LOH) 来自父系或母系的同一区域的 DNA ，有多形性的变 化(如 SNP、STR、VNTR) ，但並不改变该区域基因 的功能，称异质性的变化 癌化过程丧失此多形性的变化称之，此位臵常是抑 癌基因的所在
微小残癌的检测 ( minimal residual disease ， MRD) 当恶性肿瘤经过治疗后，有时会有残留的癌细 胞 做细胞 FISH的分析，或者使用流式细胞分析 利用外周血液及定量 PCR 的方法来检测有明确 特异性位点的基因突变或染色体重排 检测血中转移的腺癌，鳞状上皮癌等非血液的 肿瘤
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箭头所指表示 肿瘤的LOH现象
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检测MSI (microstatellite instability )
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细胞间期 可表现特征性的ABL-BCR融合基因
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