国家自然科学基金技术路线图大全共份
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2. 用 AWR 评分评估此基因敲除小鼠 的内脏敏感性，以明确此基因是否 为 IBS 的致病原因
初步筛选出IBS差异蛋白质和分子标记物 筛选某个差异蛋白质进行功能研究 导入胚胎干细胞（ES）
ES细胞培养,以筛选发生定点重组的ES细胞 植入子宫
繁殖，获基因敲除纯合体小鼠
EGFP 基因
PCR
SD大鼠分组正常组、模 型1组和模型2组各10
正常组
条件应激制备内脏 高敏感大鼠模型
腹腔注射白蛋白制备 内脏高敏感大鼠模型
差异蛋白质点的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化
正常组和模型1、2组样品的制备 DIGE试剂(Cy2、Cy3、Cy5) 标记 蛋白样品的 IEF 和 PAGE 电泳分离
荧光扫描、分析差异蛋白质 质谱的多肽指纹图、微测序分析
动物实验：分别于术后 3 天、7 天、14 天、21 天、28 天取血液及肝脏标本， 采用常规生化法检测肝功能， Northern blot、Western blot 检测 DcR3 基因在肝脏中的表达情况，免疫 组化法检测受体 CD4+、CD8+淋巴细胞在 供肝中的浸润情况，TUNEL 法检测供肝 中细胞凋亡情况，常规石蜡切片 HE 染 色观察移植排斥反应的发生情况
甲基化抑制/启动剂作用 EBs 后的基因表达分析
技术路线： 淋巴瘤患者
临床资料 病理活检
常规病理组织学诊断与分型
制成单个核
RT-PCR 诊断：t（14；18）,
细胞悬液
t（11；18）,t（11；14）,t（8；
14）,t（9；14）,t（2；5）等
染色体易位后形成的融合基因
相关探针直接间期 FISH： CCND1，BCL2，BCL6，PAX5， ALK，NPM，MYC，IgH
多变量药物
技术路线
mES 标准体系培养
形态学观察、倍增时间、细胞活率检测
生物学特性检测
染色体核型分析、AP 检测
免疫组化、FACS 特异标志物、RT-PCR 检测
mES
EBs 形态学观察
胞坏死性
凋亡通路
与铝致痴
呆的关系
生理负荷
体外培养的成骨细胞 (OB)和破骨细胞(OC)
基因芯片 体外 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
体外培养的成骨(OB) 细胞和破骨细胞(OC)
体外 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
超负荷 基因芯片
1、 RT-PCR 法检测 OB、OC 表达差异最大的几个基因； 2、 结合基因数据库，明确“标记”基因及功能。
加入多品种、多剂量 已知细胞凋亡诱导药品
人工制造多种不同 细胞凋亡状态的细胞
显微形态及凝胶电泳 鉴别细胞状态
葡萄糖氨基酸消耗量 高精密度检测方法
不同细胞凋亡状态 标准训练集
化学计量学数据处理
抗癌细胞药理评价新方法
中药组分
新方法评价结果
相互比对 传统方法 相互补充 评价结果
对新方法的总结评价 新方法的推广应用
有毒中药的安全使用窗口 （毒性与药效的相关分析 ）
纯度检测、药效检测
工艺 流程 优化
肉膏培养基
a -溶血链球菌33#菌株 绿豆水培养基
培养 条件 优化
生活废水培养基
培养基改良
绿豆水培养基
葡萄糖及12种氨基酸 标准品
快速HPLC方法
确定最优MS条件
确定样品前处理方法
MCF7、K562细胞模型
体外表达鉴定、收 集 AAV 病毒颗粒
转染 从雄性近交系 Wistar 大鼠股骨、 胫骨抽取骨髓，分离、纯化 HSC
体外试验：表达 DcR3 基因的 肝干细胞抑制 FasL 诱导淋巴 细胞凋亡试验、抑制 FasL 诱 导的淋巴细胞趋化试验
切取雌性近交系 Wistar 大鼠 肝脏
经门静脉注入供
植入
雌性近交系 Lewis 大鼠
非
分
化 增
mES 分化为 EBs
殖
流式细胞术、RT-PCR 检测
mES niche 模拟培养
RT-PCR 检测 LN, FN, E-cadherin 表达差异检测
免疫组化检测
FACS 检测
MSP 检测 Nanog 等 CpG 岛甲基化状态
甲基化修饰检测
ChIP 检测 H3 修饰的位置
免疫组化检测 H3R2 等的表达
二维电泳-质谱 分析中药对以上途径相关蛋白表达的影响
揭示中药影响ROS和葡萄糖/能量代谢调节平衡的作用物质、靶点和调控网络
代表性药物 文献研究
样品采集、提取物制备
毒性及其致毒机制 （肝微粒体、线粒体功能）
效应物质基础 （色谱、质谱、核磁、联用技术…)
生理/病理状态下机体对毒性物质的 应答差异表达
（系统生物学）
对象药物
有效组分/成分的制备 半制备液相色谱
有效中药的化学成分分析分离
过氧化氢造成葡萄糖 消耗降低，能量生成减 少
正常脑神经细胞
质谱检测
比较药物对葡萄糖消耗的影响
流式细胞检测仪 比较药物对ROS、抗氧化酶活力的影
HPLC-MS
microarray 分析中药以PGC-1α依赖的途径为核心的相关基因表达的影
骨界面 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
基因芯片
提取骨界面取材的 OB 和 OC
激光捕获
体内种植体—骨界 面区域的骨组织
生理负荷
骨界面 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
基因芯片
提取骨界面取材的 OB 和 OC
激光捕获
体内种植体—骨界 面区域的骨组织
超负荷
研究骨形成到骨吸收质的变化过 程中，OB、OC 基因调控机理。
技术路线
60 岁以上铝接 触人群及对照
铝染毒 SD 大鼠
和
或
不
同
死
亡
通
路
铝染毒大鼠神经
阻 断
细胞
剂
处
理
Nec-1 /
铝接触剂量/尿铝 含量调查
遗传基因多态性 检测
外周血淋巴细胞 M 受体表达 认知功能检查，MCI 诊断，AD 诊断，脑 部核磁及磁共振波 谱分析
神经行为改变
APP、Tau 蛋白 水平 氧化应激水平
大鼠结肠黏膜Western Blot验证
生物信息学分析，获得差异蛋白质DNA序列
健康人和IBS患者各6例结肠黏膜Western Blot验证
根据其 DNA 序列，按照同源重组原理，建立打靶载体
打靶载体 注射入胚泡中
通过鉴定，获得嵌合体小鼠
1. 观察和检测其基因敲除小鼠生物 学特征的改变，以明确此基因功能
神经细胞凋亡 /坏死/坏死性 凋亡/自吞噬
尿铝含量与年龄和细胞丢 失的关系
尿 铝 含 量 与 Caspase-3, LC3-II 蛋白表达的关系
铝致神经细胞丢失和/或 遗传因素与 MCI、AD 的 关系
Caspase-3,LC3-II
铝致神经 细胞死亡 的方式检 测
基 因
蛋
/
白 表
Nec-1 阻
达
断神经细
pMJ67
连接
Ery 敲除
pMJ68
SP 基因
PCR 连接
pMJ69
LTB 基因
ST1 基因
பைடு நூலகம்
融合 LTB-ST1
pMJ69-LTB-ST1 转化
Lactobacillus 口服免疫
仔猪
免疫指标
微生态指标
粘膜免疫
细胞免疫
体液免疫
重组乳酸杆菌测定
肠道菌群测定
构建携带 DcR3 基因 的腺相关病毒载体
初步筛选出IBS差异蛋白质和分子标记物 筛选某个差异蛋白质进行功能研究 导入胚胎干细胞（ES）
ES细胞培养,以筛选发生定点重组的ES细胞 植入子宫
繁殖，获基因敲除纯合体小鼠
EGFP 基因
PCR
SD大鼠分组正常组、模 型1组和模型2组各10
正常组
条件应激制备内脏 高敏感大鼠模型
腹腔注射白蛋白制备 内脏高敏感大鼠模型
差异蛋白质点的切取 胰酶对脱色后蛋白质的消化
正常组和模型1、2组样品的制备 DIGE试剂(Cy2、Cy3、Cy5) 标记 蛋白样品的 IEF 和 PAGE 电泳分离
荧光扫描、分析差异蛋白质 质谱的多肽指纹图、微测序分析
动物实验：分别于术后 3 天、7 天、14 天、21 天、28 天取血液及肝脏标本， 采用常规生化法检测肝功能， Northern blot、Western blot 检测 DcR3 基因在肝脏中的表达情况，免疫 组化法检测受体 CD4+、CD8+淋巴细胞在 供肝中的浸润情况，TUNEL 法检测供肝 中细胞凋亡情况，常规石蜡切片 HE 染 色观察移植排斥反应的发生情况
甲基化抑制/启动剂作用 EBs 后的基因表达分析
技术路线： 淋巴瘤患者
临床资料 病理活检
常规病理组织学诊断与分型
制成单个核
RT-PCR 诊断：t（14；18）,
细胞悬液
t（11；18）,t（11；14）,t（8；
14）,t（9；14）,t（2；5）等
染色体易位后形成的融合基因
相关探针直接间期 FISH： CCND1，BCL2，BCL6，PAX5， ALK，NPM，MYC，IgH
多变量药物
技术路线
mES 标准体系培养
形态学观察、倍增时间、细胞活率检测
生物学特性检测
染色体核型分析、AP 检测
免疫组化、FACS 特异标志物、RT-PCR 检测
mES
EBs 形态学观察
胞坏死性
凋亡通路
与铝致痴
呆的关系
生理负荷
体外培养的成骨细胞 (OB)和破骨细胞(OC)
基因芯片 体外 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
体外培养的成骨(OB) 细胞和破骨细胞(OC)
体外 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
超负荷 基因芯片
1、 RT-PCR 法检测 OB、OC 表达差异最大的几个基因； 2、 结合基因数据库，明确“标记”基因及功能。
加入多品种、多剂量 已知细胞凋亡诱导药品
人工制造多种不同 细胞凋亡状态的细胞
显微形态及凝胶电泳 鉴别细胞状态
葡萄糖氨基酸消耗量 高精密度检测方法
不同细胞凋亡状态 标准训练集
化学计量学数据处理
抗癌细胞药理评价新方法
中药组分
新方法评价结果
相互比对 传统方法 相互补充 评价结果
对新方法的总结评价 新方法的推广应用
有毒中药的安全使用窗口 （毒性与药效的相关分析 ）
纯度检测、药效检测
工艺 流程 优化
肉膏培养基
a -溶血链球菌33#菌株 绿豆水培养基
培养 条件 优化
生活废水培养基
培养基改良
绿豆水培养基
葡萄糖及12种氨基酸 标准品
快速HPLC方法
确定最优MS条件
确定样品前处理方法
MCF7、K562细胞模型
体外表达鉴定、收 集 AAV 病毒颗粒
转染 从雄性近交系 Wistar 大鼠股骨、 胫骨抽取骨髓，分离、纯化 HSC
体外试验：表达 DcR3 基因的 肝干细胞抑制 FasL 诱导淋巴 细胞凋亡试验、抑制 FasL 诱 导的淋巴细胞趋化试验
切取雌性近交系 Wistar 大鼠 肝脏
经门静脉注入供
植入
雌性近交系 Lewis 大鼠
非
分
化 增
mES 分化为 EBs
殖
流式细胞术、RT-PCR 检测
mES niche 模拟培养
RT-PCR 检测 LN, FN, E-cadherin 表达差异检测
免疫组化检测
FACS 检测
MSP 检测 Nanog 等 CpG 岛甲基化状态
甲基化修饰检测
ChIP 检测 H3 修饰的位置
免疫组化检测 H3R2 等的表达
二维电泳-质谱 分析中药对以上途径相关蛋白表达的影响
揭示中药影响ROS和葡萄糖/能量代谢调节平衡的作用物质、靶点和调控网络
代表性药物 文献研究
样品采集、提取物制备
毒性及其致毒机制 （肝微粒体、线粒体功能）
效应物质基础 （色谱、质谱、核磁、联用技术…)
生理/病理状态下机体对毒性物质的 应答差异表达
（系统生物学）
对象药物
有效组分/成分的制备 半制备液相色谱
有效中药的化学成分分析分离
过氧化氢造成葡萄糖 消耗降低，能量生成减 少
正常脑神经细胞
质谱检测
比较药物对葡萄糖消耗的影响
流式细胞检测仪 比较药物对ROS、抗氧化酶活力的影
HPLC-MS
microarray 分析中药以PGC-1α依赖的途径为核心的相关基因表达的影
骨界面 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
基因芯片
提取骨界面取材的 OB 和 OC
激光捕获
体内种植体—骨界 面区域的骨组织
生理负荷
骨界面 OB、OC 基因 表达谱的时序变化
基因芯片
提取骨界面取材的 OB 和 OC
激光捕获
体内种植体—骨界 面区域的骨组织
超负荷
研究骨形成到骨吸收质的变化过 程中，OB、OC 基因调控机理。
技术路线
60 岁以上铝接 触人群及对照
铝染毒 SD 大鼠
和
或
不
同
死
亡
通
路
铝染毒大鼠神经
阻 断
细胞
剂
处
理
Nec-1 /
铝接触剂量/尿铝 含量调查
遗传基因多态性 检测
外周血淋巴细胞 M 受体表达 认知功能检查，MCI 诊断，AD 诊断，脑 部核磁及磁共振波 谱分析
神经行为改变
APP、Tau 蛋白 水平 氧化应激水平
大鼠结肠黏膜Western Blot验证
生物信息学分析，获得差异蛋白质DNA序列
健康人和IBS患者各6例结肠黏膜Western Blot验证
根据其 DNA 序列，按照同源重组原理，建立打靶载体
打靶载体 注射入胚泡中
通过鉴定，获得嵌合体小鼠
1. 观察和检测其基因敲除小鼠生物 学特征的改变，以明确此基因功能
神经细胞凋亡 /坏死/坏死性 凋亡/自吞噬
尿铝含量与年龄和细胞丢 失的关系
尿 铝 含 量 与 Caspase-3, LC3-II 蛋白表达的关系
铝致神经细胞丢失和/或 遗传因素与 MCI、AD 的 关系
Caspase-3,LC3-II
铝致神经 细胞死亡 的方式检 测
基 因
蛋
/
白 表
Nec-1 阻
达
断神经细
pMJ67
连接
Ery 敲除
pMJ68
SP 基因
PCR 连接
pMJ69
LTB 基因
ST1 基因
பைடு நூலகம்
融合 LTB-ST1
pMJ69-LTB-ST1 转化
Lactobacillus 口服免疫
仔猪
免疫指标
微生态指标
粘膜免疫
细胞免疫
体液免疫
重组乳酸杆菌测定
肠道菌群测定
构建携带 DcR3 基因 的腺相关病毒载体