菊花的组织培养

②动物已分化的体细胞全能性受限制，但细 胞核仍具有全能性
植物细胞要表现全能性，步骤： 1.成熟细胞 → 分生细胞 → 胚状体 →完整植株 2.成熟细胞 → 愈伤组织 →出根出芽→完整植株

需要条件：
1.离体
2.一定的营养物质
3.植物激素：主要是生长素和细胞分裂素
4.适宜温度和pH 细胞全能性大小： 受精卵>生殖细胞>体细胞 植物细胞>动物细胞 分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分， 放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1～2min， 取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液。
（三）接种： 1．接种室消毒：
接种前用体积分数为70％的酒精将工作台擦拭
一遍，然后点燃酒精灯。因为污染的主要来源是空
气中的细菌和孢子。
2．无菌操作要求：
所有的接种操作都必须在酒精灯火焰旁完成， 每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。
5．植物激素的影响：

常用的植物激素：
生长素、细胞分裂素和 赤霉素。

生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的 关键性激素。

在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈加强的趋势。 激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向。
生长素类： 2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、 吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、 吲哚丁酸（IBA）等。
(外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。) （二）外植体消毒：
1．选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝。 2．消毒： ① 流水冲洗： 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软 刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。 ② 酒精处理： 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入 体积分数为70％的酒精中摇动2～3次，持续6～ 7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。 ③ 消毒液处理：
实验流程图：
菊花的组织培养程序： 制备MS固体培养基
外植体消毒
栽培
移栽
培养
接种
课外拓展

MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草 细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较 高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞 的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数 植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培 养基。 基于此，这种培养基就用他们的名字来命 名了。
（四）培养：


接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养 期间应定期消毒。培养温度控制在18～22℃。 每日用日光灯光照12h。
（五）移栽： 1．打开封口膜： 移栽生根的菊花试管苗之前，应先打 开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生 长几日。一般放置在20～25℃的遮荫环境 中，适应5～7d。试管苗不萎蔫，有新生 长的趋势，便可移栽。
（二）影响植物组织培养的因素： 1．植物材料的影响：
（1）不同的植物，培养的难易程度差别很大：
①烟草和胡萝卜的组织培养较为容易； ②枸杞愈伤组织的芽诱导比较难； （2）同一种植物材料的年龄、保存时间的长 短等也会影响实验结果。
菊花的组织培养一般选择未开 花植株的茎上部新萌生的侧枝。
２．无机营养的影响：
20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细 胞培养成完整植株？研究者从胡萝卜根的韧皮 部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使 其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状 体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后， 获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此 植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出 来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别 无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不 经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养 出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有 核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条 件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓 的植物细胞全能性。
植物组织培养过程：
植物组织培养
离 体 细胞分裂 的 植 素>生长素 脱分化 愈 再分化 芽 物 器 （细胞分裂） 伤 （细胞分化） 官 组 根 组 织 细胞分裂 织 素<生长素 或 细 胞
植 物 体
不需要光
需要光
脱分化：由高度分化的植物器官、组 织或细胞产生愈伤组织的过程，称为 植物细胞的脱（去）分化 。
MS培养基主要成分：
①大量元素: N、P、 K、 Ca、 S 、 Mg等 ②微量元素: B、Mn、Cu、Zn、 Fe、Mo、I、Co等 ③有机物：甘氨酸、烟酸、肌醇、 维生素、蔗糖等 ④植物激素：生长素、细胞分裂素、 赤霉素等
微生物培养基的配方和MS培养基的配 方相比，有哪些明显的不同？
微生物培养基以有机营养为主。与微生物 的培养不同， MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐 混合物包括植物生长必须的大量元素和微 量元素两大类。
蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质；
维生素能促进细胞分裂和诱导器官分化； 甘氨酸是蛋白质的组成成分，也是有机氮源。
4．温度、光照、pH的影响： 温度： 大多数植物组织培养控制在23～27℃， 低于15℃时植物组织会表现生长停止； 高于35℃时对植物生长不利。 菊花的组织培养控制在18～22℃。 光照： 菊花每日用日光灯照射12h。 pH： 不同植物对培养基最适pH的要求不 同，大多数控制在5～6.5。 菊花的组织培养控制在5.8左右。
再分化就是细胞分化过程。
细胞分化

细胞分化：在植物的个体发育过程中，细胞在形态、结构和生
理功能上发生稳定性差异的过程，叫做细胞分化。
细胞分化的特点：
①持久性 : 细胞分化贯穿于生物体整个生命进程中 , 在胚胎期达到最大限度 ②稳定性和不可逆性 : 一般来说 , 分化了的细胞将一 直保持分化后的状态,直到死亡 ③普遍性:生物界普遍存在,是生物个体发育的基础
离体的植物组织或细胞，在培养了一段时 间后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。
方式：有丝分裂
脱分化就是有丝分裂的过程。
愈伤组织：由离体的植物器官、组织或细胞，通 过细胞分裂形成的细胞团，叫做愈伤 组织。 特点：细胞排列疏松而无规则，高度液泡化；呈 无定形状态的薄壁细胞。
再分化：由脱分化产生的愈伤组织重新 分化形成根或芽等器官的过程，叫做再分化。
主要是大量元素和微量元素的影响。
A．大量元素: N、P、 K、 Ca、Mg 、 S等；
B．微量元素:
B、Mn、Cu、Zn、 Fe、Mo、I、Co等
其中： Ｎ、Ｐ主要影响蛋白质、核酸的合成；
K、 Ca、Mg、S主要影响酶的活性。
3．有机营养的影响：
主要是甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖的影响。 其中：
课题1
菊
菊花的组织培养
花
的
品
种
繁
多
菊花是菊科菊属的多年生宿根草本 植物,是我国的传统名花和世界四大切花之 一。 长期以来菊花采用分株、扦插等无性 繁殖方法进行繁殖。但是传统的繁殖方法 易受环境影响 , 繁殖周期长 , 随着市场需求 的急剧增加,已经不能满足市场日益发展的 需要。
植物组织培养属于无性生殖中营养生 殖 营养生殖包括：
实验操作
（一）制备MS固体培养基： MS培养基包括20多种营养成分，实验室 一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备。 1．配制各种母液： ①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩 100倍，常温保存。
②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一 般可按1mg/mL的质量浓度单独配制成母液。 ③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的 浓缩倍数，计算用量。
扦插
嫁 接
压条
植物组织培养：
当植物细胞脱离了原来所在植物体的 器官或组织而处于离体状态时，在一定的 营养物质、激素（细胞分裂素、生长素）和其他外 界条件（温度、pH、光照、无菌等）的作用下，就 可能表现出全能性，发育成完整的植株， 这种培育新植株的方法，叫做植物的组织 培养。
植物组织培养发展简史
基础知Βιβλιοθήκη Baidu：
（一）植物组织培养的
细胞全能性

理论基础
概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成


完整新个体的潜能。
基础：生物体的每一个细胞都包含有该物种所


特有全套遗传物质，都有发育成为完整
个体所必需的全部基因。因为它们都是

由同一个受精卵细胞有丝分裂分化而来。
细胞全能性的特点：
①高度分化的植物细胞在离体的情况下，在 一定的营养物质、激素和其他适宜的外界 条件下，才能表现其全能性。
（六）栽培： 将幼苗移栽后，每天观察记录幼苗生 长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
植物组织培养的注意事项：
1 、培养基的配置。要根据不同的材料， 不同的物种，选择合适的培养基，最好有 一组实验取得。做培养基的过程中注意调 剂培养基的 PH 值，有些高温分解的激素 要过滤灭菌等。
2．清洗转移：
用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植 到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段 时间。
3．移栽： 待幼苗长壮后再移栽到土壤中。
珍珠岩： 珍珠岩是一种火山喷发的 酸性熔岩，经急剧冷却而成的 玻璃质岩石，有弧形或圆形裂 隙，如珍珠的结构，所以被命 名为珍珠岩 。 蛭石： 是一种天然、无毒 的矿物质，在高温作用下 会膨胀的矿物。它是一种 比较少见的矿物，属于硅 酸盐。
科学家在植物激素对器官建成，及改进培养基配方等方 面所取得的成果，极大地推动了组织培养技术的发展， 使这项技术可以实际应用于快速繁殖、品种改良等方面。 20世纪50年代初期，法国科学家利用组织培养技术成功 地脱除了染病大丽花植株所携带的病毒，从而为脱毒苗 的生产提供了一种可行的途径。现在凭借组织培养技术 来脱除植物的病毒已经在生产中广泛应用。20世纪50年 代中期，由于细胞分裂素的发现，使组织培养状态下外 植体芽的形态建成成为可人为调控的因素，从而使在组 织培养状况下进行植株再生成为现实。进入60年代以后， 组织培养技术在基础理论、实际操作方面不断取得进展， 相继在植物体细胞杂交、单倍体育种、种质资源保存、 快速育苗、人工种子制造、次生代谢物生产等方面有了 可喜的成果。时至今日，组织培养技术已经成为基础坚 实、易于掌握、应用面广的一种技术手段。
3．材料的切取和接种： 将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿 中切成0.5～1cm的小段，用镊子夹取 菊花茎段接种。
4．接种注意事项：
① 每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为 70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火 焰上烧一遍，冷却后再接种。
② 外植体在培养基中要分布均匀，放置外植 体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝 卜3～4块，菊花6～8块，也不要太少，以 充分利用培养基中的营养成分和光照条件。 ③ 插入时应注意茎段方向，形态学上端朝上， 形态学下端朝下，不要倒插。茎段、茎尖 基部插入培养基利于吸收水分和养分。
使
用
顺
序
实
验
结
果
先使用生长素，后使用细胞分裂素 有利于细胞分裂，但不利分化 先使用细胞分裂素，后使用生长素 细胞既分裂也分化 同时使用 使 用 比 例 分化频率提高 实 验 结 果
细胞分裂素
细胞分裂素
> <
生长素
有利于芽的分化，抑制根的形成
生长素
有利于根的分化，抑制芽的形成
促进愈伤组织的形成
细胞分裂素 ＝ 生长素
2．配制培养基：
① 配制培养液：配制1LMS培养基时，先将称好的琼 脂加入800mL蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入 蔗糖30g，取配制好的大量元素、微量元素、有机 物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容 至1000mL。
② 调pH： ③培养基的分装: 分装到锥形瓶中，每瓶分装50mL或100mL。 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因 此不必添加植物激素。 3．灭菌：将分装好的培养基连同其他 器械一起进行高压蒸汽灭菌。
作用：2，4－D有利于愈伤组织的生长； IAA、NAA、IBA有利于器官分化。
细胞分裂素类： 激动素（KT）、6－苄基嘌呤 （ 6－BA）、玉米素（ZT）等。 作用：促进细胞的分裂与分化，其中KT能 明显促进芽的分化而抑制根的形成。 赤霉素类： 赤霉酸（GA3）等 作用：促进不定芽和幼株伸长。
激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：
细胞分化的实质:
在个体发育过程中，不同细胞中遗传信息 的执行情况不同，即基因的选择性表达
细胞分化的结果：
在空间上细胞之间出现差异， 在时间上同一细胞和它以前的状 态有所不同。
最终形成新的个体
细胞分化的意义：
生物个体发育的基础；细胞分化使 多细胞生物体中的细胞趋向专门 化，有利于提高各种生理功能的 效率。