SD 大鼠脓毒血症

大鼠脓毒血症建立方法SD 大鼠, 体重190～270 g ,雌雄均有, 禁食24 h 后进行实验。

用2.5 %戊巴比妥钠按1 ml/ kg 体重, 腹腔注射麻醉大鼠, 随机分为实验组和对照组(假手术组) 。

常规消毒腹部, 在下腹部正中央切口, 长约2 cm , 打开腹腔寻找盲肠, 小心分离其远端与大肠的系膜, 盲肠内如有粪便, 则把粪便小心挤向相连的大肠, 实验组在盲肠远端1/ 2 处用无菌4 号丝线紧紧结扎, 并用无菌7 号针头在已结扎盲肠远段中央处贯通穿刺。

然后把盲肠推回腹腔, 关闭腹腔, 逐层缝合。

对照组仅做开腹分离盲肠远端与大肠的系膜及关腹手术。

术后按50 ml/ kg 体重皮下注射生理盐水, 补充手术中丢失的体液, 连续观察24h , 整个实验过程中在室温22～25 ℃环境进行并让大鼠自由饮水。

在盲肠结扎前、结扎后8 h、16h、和24h 在无菌条件下取大鼠尾血1 滴进行细胞培养, 实验组还在无菌条件下取腹腔渗出液少许进行细菌培养。

用结扎整个盲肠加穿刺的方法可复制出动物的理想败血症模型, 因为动物模型血液细菌培养阳性, 培养出来的细菌与感染灶细菌完全或部分相同, 动物表现与临床败血症类似, 重复性好, 模型复制后有一定的存活时间供研究之用。

有人把结扎整个盲肠改为结扎盲肠1/ 2 , 把穿刺盲肠2 次改为贯通穿刺盲肠, 操作更为简便, 效果也令人满意。

造成盲肠缺血坏死, 自身肠道的细菌进入腹腔造成感染。

血液培养显示, 在CL P 后16 h , 血液已有大肠杆菌及绿脓杆菌生成, 与腹腔渗出液细菌培养结果相同; 培养出的菌种与报道略有不同, 这可能是由于大鼠来源及实验室的条件不同造成的。

实验组动物术后24 h 活杀, 见盲肠结扎的远端已发生坏死, 穿刺的针孔明显, 腹腔感染, 有臭味的渗出液,但腹腔未见粪便, 这与人类阑尾穿刺并发腹膜炎等疾病过程相似。

大鼠盲肠结扎加穿刺引起的败血症存活情况与结扎盲肠部分的多少, 穿刺针孔的多少和大小有关。

针孔多, 针孔大, 死亡率高。

上述结扎整个盲肠并用9号针头刺孔2 个, 24 h 有75 %大鼠死亡。

有人结扎1/2 盲肠并用7 号贯通穿刺, 24 h 无大鼠死亡。

另外,饲养动物环境也是影响动物存活率的重要因素。

有人曾在室温30 ℃时, 饲养CL P 大鼠5 只, 结果在24 h内全部死亡。

大鼠脓毒症预后判断指标集及预测模型的初步研究脓毒症是感染导致的全身炎症反应综合征(SIRS),是各种严重创伤、烧伤、休克、再灌注损伤及外科大手术后常见的并发症,其死亡率高达30-50%。

脓毒症的发生机制极其复杂,其复杂性和非线性的特点导致了对其诊断、预测和治疗的不确定性。

这也是当前脓毒症死亡率居高不下的主要原因。

因此,研究脓毒症生物标志物,探讨脓毒症诊断、预测、疗效评估的新方法,以指导脓毒症的防治,降低其发病率和死亡率,具有重要的科学意义。

本课题采用盲肠结扎穿刺(CLP)制备大鼠脓毒症模型,观察大鼠CLP前后血清炎症介质TNF-α, IL-1β, IL-6,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),高迁移率族蛋白 1 (HMGB1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及血尿素氮(BUN),肌酐(Cr),乳酸脱氢酶(LDH),谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),肌酸激酶(CK)和血常规的变化,探讨上述指标的改变及其与脓毒症大鼠预后的关系,试图筛选出有意义的指标建立指标集,并采用该指标集对脓毒症大鼠进行预后评估,以改善脓毒症大鼠预后评估的敏感性、特异性和准确度。

结果如下：1.大鼠CLP模型复制：大鼠行CLP后,6h开始死亡,12-24h死亡最多,72小时死亡率为59%；血清炎症介质TNF-α, IL-1β, IL-6, GM-CSF及HMGB1水平显著升高；CLP术后12h处死大鼠,发现多个器官(心、肝、肺、脑及肾)发生组织形态学改变。

2.根据CLP术后72h是否死亡分为存活组和死亡组。

存活组大鼠CLP术后12小时ALT, AST, HMGB1, IL-6以及MCP-1水平高于术前(p<0.05或p<0.01)；白细胞计数、血小板计数、CK及IL-1β水平低于术前(p<0.05或p<0.01)。

死亡组大鼠CLP术后12小时体温、红细胞计数、红细胞比积、BUN,ALT,AST,HMGB1,IL6以及MCP1水平高于术前(p<0.05或p<0.01)；白细胞计数、血小板计数、血清肌酸激酶水平低于术前(p<0.05或p<0.01)。

3.死亡组CLP术后12小时BUN, Cr, ALT, LDH, CK, IL-6以及MCP-1水平高于存活组(p<0.05或p<0.01)；血小板计数、血清HMGB1及GM-CSF水平低于存活组(p<0.05或p<0.01)。

4.CLP术后12小时体温以及血清尿素氮、肌酐、谷丙转氨酶、肌酸激酶、IL-6和MCP-1水平与大鼠存活结局呈负相关,而血小板计数、血清HMGB1及GM-CSF与大鼠存活结局呈正相关。

5.为判断各指标在脓毒症预后预测中的价值及选择最优的指标集,采用Logistic回归对上述与脓毒症预后相关的指标进行了分析,发现将尿素氮、肌酐、IL-6.GM-CSF纳入方程,则预测的敏感性(86.2%)、特异性(83.3%)以及准确度(84.7%)均达最高,据此建立下述回归方程：Logit P=-8.367+1.124BUN+1.134Cr+0.003IL6-0.249GM-CSF其中P为死亡与存活概率之比,LogitP为死亡与存活概率之比的自然对数。

综上所述,本研究在成功复制了大鼠CLP脓毒症模型基础上,筛选出与大鼠脓毒症预后相关的指标,并选择最优指标集建立了脓毒症预后预测模型。

该预测模型显示,脓毒症大鼠血清BUN,Cr,IL-6水平升高及GM-CSF水平降低时预后不良。

上述结果为临床脓毒症的预后判断和疗效评估提供了新的实验证据和研究思路。

脓毒症模型大鼠肿瘤坏死因子α和肝细胞凋亡的关系摘要：目的：探讨脓毒症大鼠肿瘤坏死因子a（TNFa）与肝细胞凋亡的关系以及对肝功能的影响。

方法：大鼠随机分为正常对照组和实验组，实验组采用盲肠结扎穿孔术（CLP）致脓毒症大鼠模型，分别于术后30、60、120、180 min （CLP术后30、60、120、180 min组）处死动物，测定肝组织和血浆TNFa 水平，并检测肝细胞凋亡的情况，同时测定丙氨酸氨基转移酶（ACL）正常对照组相比，CLP术后30、60、120、180 min组肝细胞凋亡数、血清TNFα、ALT 水平均明显升高（P<0.01），有随着时间的延长增加的趋势；与正常对照组相比，CLP术后120、180 min组血清AST含量明显升高（P<0.01）；CLP术后大鼠肝组织、TNFα表达强度随时间延长而有增强的趋势。

结论：CLP后大鼠肝脏产生大量TNFα，与肝细胞凋亡有密切关系，肝功能受到损伤。

脓毒症是严重创伤、感染及大手术后常见的并发症，可引起脓毒症休克及多脏器功能障碍综合征（MODS）。

随着分子生物学和基因分析技术的发展和应用，人们对脓毒症发病机制的了解日益加深。

肝脏是脓毒症过程中最易受损的器官之一，肝细胞凋亡是造成肝脏损伤和肝脏疾病最基本的中心环节［1］,肿瘤坏死因子α(TNFα)是肝脏的一个主要炎症因子和效应分子，它与肝细胞凋亡的关系甚为密切［2］。

我室采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症大鼠模型，观察TNFα和肝细胞凋亡的关系以及脓毒症大鼠肝功能的变化，为临床防治脓毒症提供实验依据。

1材料与方法1.1实验动物及模型制备雄性Wistar大鼠30只，清洁级，体重180～220g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验前饲养1周，禁食过夜，自由饮水。

30只大鼠分为2组，实验组24只，参照文献［3］的方法行CLP，建立脓毒症大鼠模型。

20％乌拉坦腹腔注射麻醉后固定，沿腹正中线作1.5 cm切口，结扎盲肠根部，避免结扎回肠及盲肠系膜血管，用18号针穿刺盲肠4次，将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口，分别于CLP术后30、60、120和180 min （CLP 术后30、60、120、180 min组）断头取血，分离血清，并留取肝组织标本，48～72 h内行石蜡包埋，切片4.5 μm厚，脱蜡后常规HE染色。

正常对照组6只，麻醉后不进行盲肠结扎穿孔，其余同CLP组。

1.2观察指标和方法1.2.1肝细胞凋亡原位末端标记检测(TUNEL)［4］采用ＴＵＮＥＬ法进行检测肝细胞凋亡，计算5个高倍视野（400）下的凋亡细胞数，凋亡指数以每百个细胞中的凋亡数表示。

1.2.2肝组织TN Fα的免疫组化检测及结果判定常规石蜡切片脱蜡，3％H2O2处理10 min消除内源性过氧化物酶，PBS冲洗3 min×3，加枸橼酸修复液放入微波炉（70°C）8 min，自然降温至室温，PBS冲洗3 min×3。

湿盒中滴加小牛血清，室温放置25 min，加入TNFα抗体Ⅰ室温放置2 ｈ，再滴加ＴＮＦα抗体Ⅱ室温放置20 min后，滴加抗体Ⅲ，20 min后室温显色15 min。

PBS 冲洗3 min×3，苏木素复染，常规封片，镜下观察。

结果判定：阴性：细胞及间质内着色（－）；弱阳性：细胞内见淡黄色颗粒（±）；阳性: 细胞及间质内见棕黄色颗粒（+）；中等阳性：细胞及间质内见较深棕黄色颗粒（++）；强阳性：细胞及间质内见大量深棕黄色颗粒（+++）。

1.2.3血清TNFα、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平的测定采用放射免疫法测定血清ＴＮＦα水平，试剂盒购自北京东亚免疫所。

采用CX7自动生化分析仪（美国Beckman公司）检测ALT、AST水平。

1.3统计学处理所得数据以±s表示，计量资料采用t检验、方差分析进行统计学处理，检验水准α=0.05。

2结果2.1肝脏病理组织学观察正常对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞形态结构正常，肝窦清晰，窦内皮细胞、枯否氏细胞均未见明显变化。

汇管区小叶间动静脉、小叶间胆管结构清晰，未见炎细胞。

CLP组肝细胞明显肿胀，胞浆疏松，肝小叶结构紊乱，肝窦变窄，窦腔内有胆汁聚集，门脉区有较多炎细胞浸润。

CLP术后3 h,可见肝窦间隙变宽,偶见点状坏死。

2.2各组大鼠肝细胞凋亡及变化TUNEL染色阳性细胞以肝细胞为主，很少见枯否氏细胞。

CLP术后30 min时肝组织即出现细胞凋亡，随着时间的延长细胞凋亡数逐渐增加,CLP术后30、60、120、180 min组肝细胞凋亡与正常对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）(表1)。