4.发酵工业无菌技术

防
治
策
略
发酵工业无菌技术
杂菌污染的防治
染菌的检查与判断
二
发 酵
1.镜检：染色（革氏、芽孢、鞭毛等）
工
业 污
2.培养：平板、斜面
染 的
3.肉汤培养方法：
防
治 策
用这些方法没有发现染菌并不能肯定未被污
略 染，还应结合其他异常现象来判断，如溶氧
水平、CO2排放量、pH值等。
发酵工业无菌技术
谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶氧曲线
培 养
蛋白受热凝固，丧失活力所致。
基
及 设 备
在一定温度下，微生物受热后，其死活细胞 个数的变化如化学反应的浓度变化一样，遵
管 道
循单分子反应速率理论。
灭
菌
发酵工业无菌技术
在微生物受热失活的过程中，微生物不断
四 发
被杀死，活菌数不断被减少。因此，微生 物热死速率即微生物个数减少的速度与任
酵 一瞬间残存的菌数成正比。
如一些嗜冷菌的最适温度为5～l 0℃；大多数 微生物的最适温度为25～37℃；另有一些嗜
菌 热菌的最适温度为50～60℃。
发酵工业无菌技术
当微生物处于最低限温度以下时，代谢作用
四 几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高
发 限度时，微生物细胞中的原生质体和酶的基
酵 培 养
本成分——蛋白质发生不可逆的变化，即凝 固变性，使微生物在很短时间内死亡。
管 形式外，还是温度的函数。
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
※非对数残留定律：菌体循序死亡模型
四
发 某些菌体受热死亡的速率不符合对数残留定
酵 培
律。将其N/N0对灭菌时间t在半对数坐标中
养 基 及
标绘得到残留曲线不是直线，这主要是菌体 以芽孢形式存在的原因。
设
备
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
的 个别发酵罐连续染菌和偶然染菌：个别发酵
防 治
罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀
策 略
门的渗漏或罐体腐蚀磨损等。
发酵工业无菌技术
3.不同染菌的时间分析
二 种子阶段 发酵初期
发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
发酵后期
发酵工业无菌技术
杂菌污染途径及预防
1.种子带菌及防止：
二
发 带菌的原因
一 概 述
发酵工业无菌技术
二 发酵工业污染的防治策略
污染的危害
二
发 染菌是发酵工业的致命伤。轻者培养基利用
酵 工
率下降；产品分离困难；发酵异常；影响产
业 污 染
品质量；重者造成“倒罐”；造成严重经济 损失，扰乱生产秩序，影响生产计划。
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
二 在现有的技术条件下要做到完全不染菌是不
培 养
且结构致密，热不易透过;③芽孢的游离水
基 分少，蛋白质含水量较营养细胞蛋白质含
及 设
水量低。
备 管 道
Байду номын сангаас
在实际生产中，不能完全了解杂菌的数量 和类型，以相对热阻大的芽孢作为灭菌的
灭 菌
依据。
发酵工业无菌技术
微生物热死灭动力学方程：对数残留定律
四 微生物热致死是指微生物受热失活直到死亡，
发 酵
微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶
的
防
治
发酵工业无菌技术
三 发酵工业的无菌技术
灭菌的方法有：干热灭菌法，湿热灭菌法，
三 火焰灭菌法，电磁波、射线灭菌法，化学药
发 品灭菌法及过滤除菌法。根据灭菌对象和要
酵 工
求不同选用不同的方法。
业
的
无
菌
技
术
发酵工业无菌技术
四 发酵培养基及设备管道灭菌
四
发 发酵生产中主要采用湿热灭菌的方法
酵
培
养 基
基
及
设
备
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
湿热灭菌就是根据微生物的这种特性进行的。
四 杀灭细菌营养体采用较低温度即可；而芽孢
发 细菌的芽孢能经受较高的温度。一般讲，灭
酵 培
菌的彻底与否以能否杀死芽孢为标准。
养 基
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致
及 设
死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为
备 致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致
培
养
基
及
设
备
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
用 N 表示活菌个数，则活菌的减少率(死亡
四 率)与 N 呈线性关系即：
发
酵 培 养
dN K N
基
dt
及
设 备
K：比热死亡速率常数，min-1
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
在恒定温度下，将方程积分，边界条件为：
四 t：t0= 0 → t = t；N：N = N0 → N = N；
发
酵
N dN
t
N
培 养 基
K dt ln Kt
N N 0
t0
N0
及 设 备
N N0eKt
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
灭菌操作中，为达到一定的灭菌要求，即
四 发
N/N0 为某值，如 10-16。则所需灭菌时间即 可由下式求出：
酵
培 养 基 及
ln N K t ln N0 K t t 1 ln N0
N0
N
KN
设
备 管
该式叫做对数残留公式
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
若要求灭菌后绝对无菌，即N = 0 ，则从公
四 式可以看出灭菌时间将等于无穷大。
发 在生产上，通常取 N = 10-3 个/罐 为计算标
酵 培
准，即微生物污染降低到处理 1000 罐中只
养 基 及
残留 1 个活微生物的程度，此数已能满足 生产的要求；
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
——正常发酵溶氧曲线；----异常发酵溶氧曲线； -．-异常发酵光密度曲线；
发酵工业无菌技术
发酵染菌率和染菌原因分析
发酵染菌率
二
发 发酵染菌率：一年内染菌批数占总的投料批
酵 工
数的百分率；
业 污
染菌原因分析：
染 的
1.染菌的杂菌种类分析
防 治
耐热性芽抱杆菌多是由于设备存在死角或培
治 发酵后期 如杂菌量不大，可继续发酵；如污
策 略
染严重，可采取措施提前放罐；
发酵工业无菌技术
染菌对产物提取和产品质量的影响
二
发 过滤：粘度加大；菌体大多自溶；基质残留
酵 工
浓度加大；降低过滤收率。
业 萃取：水溶性蛋白质升高，易发生乳化；
污 染
离子交换：杂菌易被离子交换树脂吸附，大
的 大降低离子交换树脂的交换量
业 污
高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的
染 危害较大；
的
防
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同污染时期对发酵的影响
二
发 种子培养期 菌浓低，营养丰富；灭菌；
酵 工
发酵前期 杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的
业 繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；
污 染
发酵中期 严重干扰生产菌的繁殖和产物的生
的 防
成；并罐、提前放罐等；
及
设 备
K A eE RT
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
由: K A eE RT两边取对数
四 发 酵
ln K E ln A RT
培 养 基
表明：ln K 与 1/T 之间呈直线关系，其斜 率为 –ΔE/R，在不同 T 时做灭菌试验，求
及 设
得相应的 K 值，即可求出ΔE。
备
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
KJ/mol，而维生素被破坏的ΔE 约在8～100
及 设 备
KJ/mol，灭菌中，温度升高，菌体死灭速度 的增加远大于营养成分被破坏的增加；这就
策 略
养液灭菌不彻底。球菌、酵母等可能是从蒸
汽的冷凝水或空气中带来的。霉菌大多是灭
菌不彻底或无菌操作不严格所致。
发酵工业无菌技术
2.发酵染菌的规模分析
二 发
大批发酵罐染菌：时期、种类；
酵 部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带
工 业
杂菌；中后期则可能是中间补料系统或油管
污 染
路系统发生问题所造成的。
所以整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，
强调无菌操作。
发酵工业无菌技术
除了设备应严格按规定保证没有死角，没
有构成染菌可能的因素外，必须对培养基
和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防止
杂菌和噬菌体的污染。在好氧发酵时，通
入发酵系统的空气，如果夹带有各类其他
一 的微生物。这些微生物便会在培养系统合
概 述
适的条件下大量繁殖，从而干扰纯种培养
管 道
死时间愈短。
灭
菌
发酵工业无菌技术
由于一般细菌、芽孢细菌、微生物细胞和
微生物孢子，对热的抵抗力不同，因此，
四 发 酵
它们的致死温度和致死时间也有差别。微 生物的这种对热的抵抗力常用“热阻”表
培 养
示。
基
及
设
备
管
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
相对热阻：指在相同条件下两种微生物热
阻的比值。
四 发 酵
芽孢的热阻特别高的原因：①芽孢具有吡 啶二羧酸，能增强对热抵抗力;②芽孢厚而
设 备 管 道
这样对于不同 N0 的培养基，其灭菌时间不 同，即 t = t (N0) 。
灭
菌
发酵工业无菌技术
根据
四
t 1 ln N
发 酵
K N0
培
养 基 及 设 备
在给定的温度条件下，t 与 ln N0/N 呈直线 关系，其斜率为 -1/K ；当 N0 给定后，t 决 定于 K ；K 除了决定于菌体的种类及存在
二 发
紫外线灭菌灯照射20~30分钟，配合使用化 学灭菌药剂；无菌室内无菌度的要求是：
酵 把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放
工 业
置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的
污 染
菌落在3个以下为好。
的 防
灭菌锅 灭菌操作时需要注意排气管是否畅
治 策
通；
略
发酵工业无菌技术
2.无菌空气带菌及防止；
二 3.培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
发酵工业无菌技术
以上可以看出：ΔE 同 T 一起决定 K 值，即：
四
发
酵 培
K KE,T
养 基 及 设
将ln K E ln A两边对T求导 RT
备
管 道 灭
d ln K dT E RT 2
菌
发酵工业无菌技术
四 d ln K dT 表示ln K对T的变化率,
菌
发酵工业无菌技术
四 发 酵 培 养 基
dNs dt
kRNR
ksNs
dN
R
dt
kR N R
及 设 备 管
Nt N0
kR kR ks
e
xpk
s
t
ks kR
exp kRt
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
灭菌温度、时间选择
四 温度对化学反应的影响特别显著,主要是影响
发 酵
速度常数
培
养 基
Arrhenius 方程(1889)
发 酵 培 养
即 ln K T 其值与E正相关, 即:
基
及 设
E愈高,变化率愈大,
备 管
亦即T的变化对K的影响愈大。
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
以上结论非常重要：在生产上，可利用菌体
死灭反应与营养成分被破坏反应的 ΔE差距
四 发
来作为工艺选取的依据。
酵 培
通常，菌体死灭反应的ΔE 约在200～400
养 基
发 酵
止：原料 蒸汽压力 设备死角
工 业
4.设备渗漏引起的染菌及防止；
污 染
5.操作不规范引起的染菌
的
防
治
策
略
第 发酵染菌的拯救与处理
十 一
1.种子培养期染菌的处理：灭菌，倒种；
章 2.发酵前期染菌的处理：灭菌，接种；
工
业 3.发酵中后期染菌的处理：发酵控制，提前
发 酵
放罐；
染 菌
4.染菌后对设备的处理：彻底灭菌；
酵 工
无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌
业 不彻底；操作不当。
污
染 的
种子带菌的防止
防 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在
治 策
每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平
略 板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂
菌。严格技术规范种子培养的设备和装置
发酵工业无菌技术
无菌室 室内布置应尽量简单，通常用30瓦
生产中需要解决的问题：
及
设 杀灭培养基中的杂菌
备
管 避免培养基中营养成分的破坏
道
灭
菌
发酵工业无菌技术
湿热灭菌原理
四 微生物的热阻
发 酵
表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。
培 养
指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热
基 及
方式)下的致死时间。
设 备
每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，
管 道 灭
四 发酵工业无菌技术
发酵工业无菌技术
一 发酵工业的无菌处理
在工业微生物培养过程中，只允许生产菌存
在和生长繁殖，不允许其他微生物共存，因
此所有发酵过程，必须进行纯种培养；特别
一 概
是在种子移植过程、扩大培养过程以及发酵
述 前期，如果杂菌一旦侵入生产系统，就会在
短期内与生产菌争夺养料，严重影响生产菌
正常生长和发酵作用，以致造成发酵异常。
发酵工业无菌技术
对耐热性的微生物芽孢死亡规律的描述，具
四 有代表性的模型为Prpkop & Humphey提出
发 的“菌体循序死亡模型”。该学说认为：芽
酵 培
孢的死亡是渐进的，由耐热的芽孢（R型）
养 基 及
转变为死亡的芽孢(D型），需经过敏感的中 间过程（S型）。
设
备
管
道 灭
NR kR Ns ks ND
发 可能的。目前要做的是要提高生产管理水平，
酵 工
尽可能防止发酵染菌的发生，而且一旦发生
业 污 染
染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取 相应的有效措施，把染菌造成的损失降低到
的 防
最小。
治
策
略
发酵工业无菌技术
不同染菌对发酵的影响
二 如：
发 酵 工
青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌 的危害大；
过程的正常进行，甚至使培养过程彻底失
败导致倒罐，造成严重的经济损失。空气
除菌不彻底是发酵染菌的主要原因之一。
发酵工业无菌技术
灭菌指利用物理、化学的方法杀灭或除去物 料及设备中一切生命物质的过程。消毒是指 用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具 内外的病源微生物，一般只能杀死营养细胞 而不能杀死芽抱；